Bactérie bioluminescente

On a récupéré une souche de bactérie bioluminescente des fonds marins. On veut étudier les paramètres de croissance de cette bactérie.

• Bactérie bioluminescente : Littérature et paramètres de culture.
• Effet du H2O2 sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie
• Bibliographie et expérimentation
• Effet de l'asparagine sur la bioluminescence
• Asparagine
• L'effet du NaCl sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie
• Expérimentation
• Expérimentation 2
• Expérimentation 3
• L'effet de la tryptone sur la croissance et la bioluminescence.
• Expérimentation 1
• La mesure de la bioluminescence de la bactérie avec le luminomètre.
• Bioluminescence en fonction de chaque paramètre
• In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes
• In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes
• L-Asparagine vs peptone : effets sur la croissance et la bioluminescence

Bactérie bioluminescente : Littérature et paramètres de culture.

Pour étudier la bactérie bioluminescente, je me suis plongé dans le livre de Raphaël Dubois "la lumière et la vie". On nous apprend que la bactérie bioluminescente du genre photobacterium a des conditions de croissance particulière : 

• La T°C : En effet, nous savons qu'à 12°C la température du photobacterium est optimale, à 20°C la bactérie se multiplie bien, entre 30°C et 50°C la bactérie ne se multiplie pas.
• Le pH: le pH doit être légèrement alcalin ( pH=7,5). quand le pH est acide, la bioluminescence de la bactérie disparait. Nous pouvons le tester en ajouter de l'acide sulfurique. 
  
• La bactérie se développe en aérobie. en présence de gaz neutre tel que l'azote ou l'hydrogène, la bioluminescence persiste mais finit par disparaitre.

D'après la littérature, il n'y a pas de corrélation entre la bioluminescence et la croissance de la bactérie. Ce n'est pas parce que la bactérie n'émet pas de bioluminescence qu'elle ne se multiplie pas. 

Nous avons travaillé avec la souche rattail dans un milieu préparé par un laboratoire partenaire. 

Ingrédient	Quantité	Unité
Eau distillée	1000	mL
Sel marin	30	g
Levure	3	g
Glycérol	3	mL
Agar	15	g
Asparagine	10	g

Dans la littérature, le milieu utilisé pour la culture des photobactéries est différent en terme de concentration pour le glycérol (1%) para rapport à notre milieu (0,3%). De plus, les levures sont remplacés par le phosphate de potassium. 

Ingrédient	Quantité	Unité
Eau commune	1000	mL
Sel marin	30	g
Glycérol	10	mL
Phosphate de potassium	0,01	g
Asparagine	10	g

Sur la souche qu'on veut travailler, on veut vérifier différents paramètres de culture :

• La concentration en asparagine ( de 0,1% à 1%)
• Le sel utilisé (sel marin ou NaCl).
• La concentration de glycérol ( 0,3% et 1%).
• Remplacer la levure par le phosphate de potassium. 

Le genre Photobacterium regroupe des bactéries gram-négatives, souvent marines, certaines bioluminescentes, et appartenant à la famille des Vibrionaceae. Elles sont largement utilisées dans la recherche, notamment pour leurs propriétés lumineuses (ex: Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi).

Conditions générales de culture

Milieu solide

Milieux adaptés :

Conditions :

Milieu liquide

Milieux recommandés :

• Marine Broth (Zobell 2216E liquide) ou LB Broth + NaCl.

• Ajouter 2–3 % NaCl pour imiter l’eau de mer.

• Pour des cultures à long terme ou croissance rapide : agitation modérée (150–200 rpm).

Conditions :

• Incubation à 20–30 °C.

• Agitation pour aération (pour espèces aérobies).

• Suivi de croissance possible par turbidimétrie (OD600).

Bibliographie: 

1

Milieu solide

https://www.atcc.org/

2

Milieu liquide

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/3 BACTERIE PHOSPHOREUM

Titre: OPTIMUM CULTURAL CONDITIONS FOR STRONG LIGHT PRODUCTION BY PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM NOBUYOSHI MAKIGUCHI, MASANOBU ARITA, AND YOSHIYUKI ASAI 

Source: https://www.jstage.jst.go.jp/article/jgam1955/26/2/26_2_75/_pdf/-char/ja =>Voir l'effet de la variation de certains paramètres sur la bioluminescence des bactéries Photobacterium phosphoreum MT-10201 isolé d'un organe lumineux d'un poisson Physiculus japonicus (pH, température, NaCl...).

Voici le milieu "optimal" selon cet article.

Ingrédient	Quantité	Unité
Eau distillé	1000	mL
Glycérol	1	g
Polypepton	10	g
Extrait de viande	3	g
NaCl	30	g
Agar	15	g
pH	7,3

Leurs tableau font apparaître des maxima d'intensité lumineuse pour certaines concentrations : NaCl à 3% - pH à 8,5 - +0,1% d'acide malique - vitesse d'agitation à 500rpm (dans un fermenteur de 20L).

4 BACTERIE FISCHERI

Source: https://journals.asm.org/doi/10.1128/jb.95.3.975-979.1968

Plein d'espèces sur cet article

https://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/download/143152/142011/0 

Effet du H2O2 sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie

Bibliographie et expérimentation

1) Le peroxyde d'hydrogène (H2O2)

Le peroxyde d'hydrogène une molécule d'eau à laquelle on a ajouté un atome d'oxygène, c'est-à-dire l'eau oxygénée. Cette molécule possède quelques caractéristiques qui en font un bon désinfectant : c'est un produit à grand pouvoir oxydant, ce qui le rend très réactif face à la matière organique, et ce qui lui donne un vaste spectre d'activité vis à vis des micro-organismes : il a un bon pouvoir bactéricide, virucide, et même sporicide. on mécanisme d'action consiste en l'oxydation des groupes sulfhydriles et des doubles liaisons des enzymes des bactéries, en provoquant une modification de la conformation des protéines formant ces enzymes, avec la perte de leur fonction, et par conséquent, la mort cellulaire. 

2) La luciférase bactérienne et stress oxydatif.

Ce type de réaction nécessite 4 composés : la luciférase bactérienne ; la flavine mononucléotide réduite ou FMNH2 qui sert de luciférine ; un aldéhyde utilisé comme cofacteur RCHO (en biochimie, un cofacteur est une substance chimique non protéique, mais qui est nécessaire à l'activité biologique de celle-ci) ; et l’oxygène moléculaire O2. 

La luciférase bactérienne est sensible au stress oxydatif. En relisant la bibliographie, nous acons vu que des concentrations en H2O2 ont été utilisés pour voir l'intensité de la bioluminescence. En effet des concentrations de H2O2 ont été utilisés de 50 µM, 100 µM et 250 µM.

3 ) Protocole Expérimental

Pour réaliser cette expérience,  j'ai lancé 5 cultures bactériennes avec 200µL de la suspension mère de bactérie bioluminescente et 10mL de milieu classique. J'ai transféré 2mL de cette culture dans des cuves de spectro. J'ai ensuite fait des mesures de DO de cette culture au bout de 1h d'incubation.

Après la lecture de la DO j'ai ajouté le H202 aux concentrations voulus dans les cuves. j'ai préalablement dilué au 1/1000ème dans un erlenmeyer pour avoir une concentration de 8,79mM. Puis j'ai ajouté 11µL, 22µL et 55µL dans les cuves de spectro pour être à 50µM, 100µM et 250µM. et j'ai mesuré les DO toutes les heures. 

DO Témoin 1	DO témoin 2	DO avec 50µM	DO avec100µM	DO avec 250µM
DO 1h= 0,091	DO 1h= 0,071	DO 1h= 0,081	DO 1h= 0,087	DO 1h= 0,086
DO 2h= 0,100	DO 2h= 0,095	DO 2h= 0,093	DO 2h= 0,090	DO 2h= 0,087
DO 3h= /	DO 3h= /	DO 3h= /	DO 3h= /	DO 3h= /
DO 4h= 0,163	DO 4h= 0,161	DO 4h= 0,161	DO 4h= 0,158	DO 4h= 0,143
DO 5h= 0,252	DO 5h= 0,246	DO 5h= 0,234	DO 5h= 0,229	DO 5h= 0,207
DO 6h= 0,362	DO 6h= 0,364	DO 6h= 0,341	DO 6h= 0,326	DO 6h= 0,301
DO 7h= 0,475	DO 7h= 0,466	DO 7h= 0,46	DO 7h= 0,45	DO 7h= 0,433

Série 1: Témoin sans H202   Série 2 : Témoin sans H202   Série 3: 50µM de H202   Série 4 : 100µM de H202 Série 5: 250 µM de H202

On observe que le H202 a une influence sur la croissance de la bactérie. En effet, la DO baisse en fonction de la concentration du H2O2. A ces concentrations, le H2O2 ne tue pas la bactérie mais ralenti sa croissance. Cependant, nous n'avons pas observé de différences sur la bioluminescence de la bactérie. Je pense que l'enzyme a besoin d'un cofacteur (FMN) pour pouvoir réagir à l'oxyfation du H2O2. C'est une réaction d'oxydo-réduction. 

Effet de l'asparagine sur la bioluminescence

Asparagine

Informations

• Alan KERNANEC, Steve HUBERT
  
• alan.kernanec@sorbonne-universite.fr ; steve.hubert@sorbonne-universite.fr
• FabManagers espace Biologie/Chimie
• 10/2023

Contexte

Afin de tenter de réduire le coût de revient d'un milieu de culture spécifique à une souche de bactérie bioluminescent nous avons cherché à optimiser la quantité des certains constituants.

La 1ère publication du protocole de culture datant des années 1910 (La Vie et la Lumière ; Raphaël Dubois ; Félix Alcan Paris, 1914), certains produits sont disponibles avec un niveau de pureté non accessible à l'époque qui justifie de nouveaux essais.

Nous nous sommes penchés en particulier sur un acide aminé de ce milieu qui représente à lui seul près de la moitié du coût final : l'asparagine.

Objectifs

Tester des milieux à différentes concentrations décroissantes d'aparagine pour déterminer jusqu'où il est possible de réduire tout en maintenant la bioluminescence optimum.

En réalité il est probable que seule la L-asparagine soit utilisable par les organismes bioluminescents, la D-asparagine restant inutilisée dans le milieu.

Or dans les années 1910 si l'asparagine était déjà disponible avec un très bon niveau de pureté, il n'est pas précisé si la différence était faite entre ses deux formes enantiomères. L'optimisation peut être envisagée de ce côté.

Consommables

• souche de cellules bioluminescente
  
• yeast exctract (0,75g) 
  
• glycérol (0,75mL) 
  
• asparagine (1g) 
  
• NaCl (7,5g)
• eau distillée 250 mL
• divers (aluminium, coupelles de pesée, anses...)

Matériel et Machines utilisés

• erlenmeyer de 25 mL (x14), erlenmeyer 250 mL (x2)
• autoclave de paillasse (cycle 121°C/20min)
• balance de précision
• papier pH
• pipetman 200µL, 1000µL
  

Protocole

Nous allons tester 4 concentrations différentes soit de 4 séries de triplicats (12 échantillons) suivis sur 48h.

1/Préparation et stérilisation de 2 solutions-mères :

-1 erlenmeyer contenant 100 mL à 10g.L-1 de L-asparagine

-1 erlenmeyer contenant 150mL à 0g.L-1 de L-asparaigne

Observation :

Avec les concentrations de 0 ; 2,5 ; 5 ; 10 et 2 témoins

Date	12/10/23 à 9h30	13/10/23 à 9h45	14/10/23 à 9h30

Par la suite, nous avons fait un autre dosage avec les concentration de 0 ; 0,5 ; 1 et 2,5

Date	17/10/23 à 12h30	17/10/23 à 17h	18/10/23 à 9h30

Résultats :

L'effet du NaCl sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie

Expérimentation

                     

1) Protocole expérimental.

J'ai mesuré la densité optique (DO) avec le spectrophotomètre à 600nm pour évaluer l'évolution de la croissance microbienne den fonction du sel. j'ai donc utilisé deux types de sels :

• Le NaCl pur (99,5%)
• Le sel marin Instant ocean. ( 85% de NaCl) 

J'ai donc mis 200 µL d'une suspension mère de la souche de photobactéries Rattail  bioluminescente et 10mL de bouillon de culture avec du NaCL et avec du sel marin pour comparer l'efficacité de ces deux milieux de culture. J'ai ensuite mesuré la DO toutes les heures.

On a utilisé des cuves en polystyrène et le spectrophotomètre biochrom portable. On a fait le blanc avec les milieux et on a mesuré la DO des bactéries toutes les heures. 

2) Résultats 

Temps (heure)	DO sel marin	DO NaCl
1	0,030	0,014
3	0,082	0,042
4	0,164	0,081
5	0,247	0,147
6	0,303	0,194
7	0,368	0,267
8	0,457	0,316

Tableau 1: Mesure de la DO le 17/04/2025 en partant de la suspension mère de 42h d'incubation.

Temps (heure)	DO sel marin	DO NaCl
1	0,022	0,017
2	0,054	0,030
4	0,154	0,082
5	0,210	0,134
6	0,240	0,170
7	0,301	0,221

Tableau 2 : Mesure de la DO le 18/04/2025 en partant de la suspension mère de 66h d'incubation.

3) Discussion 

3.1) Croissance microbienne 

On observe que la DO est plus élevée avec le sel marin ce qui indique que ce sel est plus favorable à la croissance de la bactérie que le NaCl pur. Le sel marin est riche en différents sels minéraux (figure 1) ce qui doit être plus favorable à la croissance microbienne. En traçant la courbe sur Excel , on obtient une droite sans mettre les valeurs en logarithme.  Le temps de génération de la bactérie est plus longue qu'une 1h  il faudrait donc mesurer les DO toutes les 2h pour pouvoir tracer une courbe de croissance. 

         Figure : 1 composition du sel marin 

3.2) Bioluminescence 

J'ai comparé l'intensité de bioluminescence. à 4h on commence à voir une bioluminescence mais qui est pale. on atteint le maximum de la bioluminescence au bout de 7h. Au bout de 17h, on remarque une intensité de bioluminescence plus importante avec le NaCl qu'avec le sel marin mais la différence est moins visible après 7h d'incubation.  Il n'y a pas de corrélation entre croissance et bioluminescence. En effet, quand la DO est plus élevée en présence avec le sel marin qu'avec le NaCl alors qu'à l'inverse la bioluminescence est plus élevée en présence de NaCl. On rappel que le sel marin est à 85% de NaCl là ou le NaCl en poudre est à 99,5% de pureté. 

                       Figure 2  :  Bioluminescence de Rattail sur milieu solide (17h).       Figure 3 : Bioluminescence de de Rattail sur milieu liquide (17h).

                                                                                         Figure 4:   Bioluminescence de Rattail sur milieu liquide (7h). 

Expérimentation 2

 

1) Protocole expérimental 

J'ai lancé deux cultures de bactérie :

• 200µL de bactéries + 10mL de milieu classique
• 200 µL de la suspension bactérienne + 10mL de milieu avec du NaCl

J'ai mesuré la DO toutes les heures à 600nm au spectrophotomètre portable biochrom.

2) Résultats 

DO avec le Nacl	DO avec le sel marin
DO 1h= 0,067	DO 1h=0,084
DO 2h= 0,079	DO 2h= 0,100
DO 3h= 0,094	DO 3h= 0,124
DO 4h= 0,131	DO 4h= 0,156
DO 5h= 0,190	DO 5h= 0,230
DO 6h= 0,272	DO 6h= 0,326
DO 7h= 0,363	DO 7h= 0,470

3) Discussion

La tendance se confirme. Le NaCl ralenti la croissance de la bactérie. Cependant, on observe que la bactérie a une intensité de bioluminescence plus élevée en présence de NaCl. On peut supposer que le Nacl a 99% de pureté induit un stress à la bactérie ce qui doit augmenter l'activité de la luciférase bactérienne. 

Expérimentation 3

1) Bibliographie

Des chercheurs malaisiens ont testé des concentrations de NaCl sur la bactérie photobacterium sp. Ils ont mesurés la bioluminescence de la bactérie en fonction de différentes concentrations de NaCl : 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L, 40 gl/L et 50g/L . 

2) Protocole expérimental 

J'ai préparer des milieux classiques aux concentration de NaCl de 10g/L, 20g/L, 30 g/l et 40g/L. Ces milieux ont été autoclavés. J'ai ensuite préparé 5 petits erlenmeyer dans lequel j'ai mis 200 µL de suspension bactérienne dans 10 mL de milieu. J'ai également lancé une culture avec 10ml de milieu sel marin et 200µL de suspension bactérienne. 

3) Résultats 

Figure 1: la bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration en Nacl

Le milieu utilisé	Intensité de la bioluminescence
Nacl 10g/L	0
Sel marin	+
NaCl 20g/L	+
NaCl 30g/L	+++
NaCl 40g/L	+++

4) Discussion

Nous avons obtenu des résultats différentes de la littérature. En effet, à 10g/L nous obtenons aucune bioluminescence. En revanche à 40g/L, la bioluminescence est très élevée contrairement à la littérature où ils ont obtenus aucune bioluminescence. Ces différences peuvent s'expliquer par le fait que nous ne manipulons pas la même espèce de photobactrium que dans la littérature et que la composition du milieu utilisé dans la littérature est différente. 

 

 

L'effet de la tryptone sur la croissance et la bioluminescence.

Expérimentation 1

1) Bibliographie 

3) Résultats 

                                           

Figure 1: Bioluminescence de Rattail en fonction du tryptone                     Figure 2 : Les cultures de Rattail en fonction du tryptone

Milieu utilisé	Bioluminescence
Sans tryptone	+
Tryptone 20g/L	++
Tryptone 30g/L	+++
Tryptone 40g/L	+++
Tryptone 50g/L	+++

4) Discussion 

On observe une forte bioluminescence à partir de 30g/L de tryptone ce qui concorde avec ce qu'il y a dans la littérature. Sans tryptone, on observe une bioluminescence qui est nettement moins élevée. Le tryptone est donc nécessaire au bon fonctionnement de la luciférase bactérienne. 

 

Un milieu enrichi en tryptone (≈ 5 g/L), combiné à du glycerol (3 g/L), yeast extract (5 g/L) et NaCl (30 g/L) favorise une croissance efficace de P. phosphoreum T3 et Q67, atteignant respectivement OD ≈ 0,85 et 1,25 en 12 h à 22 °C sciencedirect.com+11pmc.ncbi.nlm.nih.gov+11mdpi.com+11.

Des formulations utilisant 1 g/L de peptone (souvent à base de tryptone) avec 20–30 g/L NaCl, glycerol et yeast extract assurent aussi une croissance stable et soutenue, dans le cadre de milieux optimisés pour la bioluminescence.

Effet sur la bioluminescence

• Un milieu complet contenant tryptone stimule la lumière : après 12 h, P. phosphoreum T3 atteint ~6,5×10⁷ RLU ; Q67 ~2,7×10⁶ RLU journals.asm.org+7pmc.ncbi.nlm.nih.gov+7mdpi.com+7.

• Dans le milieu modifié dit “Boss medium” (contenu en peptone/tryptone), la luminescence est maximale à pH 7,0, avec peptone 1 g/L, yeast extract 1 g/L, NaCl 20 g/L, glycerol 2,5 g/L et atteint un signal RLU stable (~13 600 en continu pendant >120 h) researchgate.net+1mdpi.com+1.

La mesure de la bioluminescence de la bactérie avec le luminomètre.

Bioluminescence en fonction de chaque paramètre

1) Protocole expérimental 

• On a lancé des cultures avec la suspension mère du 09/05/2025
• Pour ce faire on a mis : 200µL de la suspension mère dans 10mL de milieu.  

             

On a laissé incuber les cultures 16h à température ambiante dans la réserve. On a ensuite transféré 250µL dans les puits des microplaques. On a ensuite mesuré la bioluminescence exprimé en RLU ( Relative light unit) avec le lecteur de plaque luminomètre BertholdTech TriStar2S.    

                                       

2) Résultats

Echantillon	Mesure 1 (RLU)	Mesure 2 (RLU)	Mesure 3 (RLU)	moyenne
Sel marin	44845504	46015056	46768168	45 876 243
NaCl 10g/L	235183	112455	1790293	712643,6667
NaCl 20 g/L	60977620	60070600	58558968	59869062,67
NaCl 30 g/L	Overload	Overload	Overload
NaCl 40 g/L	Overload	Overload	Overload

                                                                           Figure 1 : La bioluminescence en fonction de la concentration de la NaCl

Echantillon	Mesure 1 (RLU)	Mesure 2 (RLU)	Mesure 3 (RLU)	moyenne
Sans glycérol	33247172	32239560	33735476	33074069,33
Glycérol 3g/L	42860224	42131648	40296944	41762938,67
Glycérol 4g/L	45816200	45822756	47212044	46283666,67
Glycérol 5g/L	30895180	31607086	32870984	31791083,33
Glycérol 6g/L	46946548	43893304	43641736	44827196

                                                                            Figure 2 : La bioluminescence en fonction de la concentration du glycérol 

Echantillon	Mesure 1 (RLU)	Mesure 2 (RLU)	Mesure 3 (RLU)	moyenne
Sans asparagine	32419202	35136032	31284540	32946591,33
Asparagine 20g/L	Overload	Overload	Overload	Overload
Asparagine 30g/L	62468408	58194472	59331008	59997962,67
Asparagine 40g/L	Overload	Overload	Overload	Overload
Asparagine 50g/L	Overload	62883208	49083528	/

                                                                      Figure 3 : La bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration en asparagine 

Echantillon	Mesure 1 (RLU)	Mesure 2 (RLU)	Mesure 3 (RLU)	moyenne
Sans tryptone	31655116	32114984	30762482	31510860,67
Tryptone 20g/L	39209212	39168668	43397976	40591952
Tryptone 30g/L	51469600	57521668	57203196	55398154,67
Tryptone 40g/L	44447328	47998668	47332372	46592789,33
Tryptone 50g/L	42574080	43918224	40970844	42487716

                                                               Figure 4 : La bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration de tryptone. 

3) Discussion

Nous avons obtenu des valeurs globalement très élevé en URL ( de l'ordre de 10^7 URL) alors que dans la littérature c'est dans l'ordre de 10^6 . Il faut préalablement dilué nos échantillons et mettre un volume plus petit (150-200µL) pour pouvoir quantifier la bioluminescence et éviter la surcharge. De plus, il faut faire un témoins négatif (eau distillé) pour avoir une valeur de référence sans bioluminescence. les conditions favorables pour la bioluminescence de la bactérie c'est 20g/L d'asparagine, 30gl/L de NaCl, 30g/L de tryptone et 4g/L de glycérol ce qui correspond à ce que l'on voit dans la littérature. Pour le NaCl, on observe qu'à 10g/L, il n'y a aucune bioluminescence mais à partir de 20g/L, la bioluminescence est plus élevée qu'avec le sel marin . Pour le glycérol , il semblerait qu'une concentration à 4g/L et légèrement plus favorable à la bioluminescence qu'à 3g/L. Nous avons observé préalablement qu'entre 0 et 10g/L d'asparagine, il n'y a pas d'influence sur la bioluminescence. En revanche, 20g/L d'asparagine suffit pour voir une intensité nettement plus élevée de la bioluminescence. 

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

L'exposition prolongée à l'O₂ génère des radicaux libres inhibant la luminescence. L'ajout d'antioxydants (ex: ascorbate) ou l'expression de superoxyde dismutase (sodA) prolonge la durée de luminescence de 40% 3.

Tableau 2 : Impact des nutriments sur la luminescence

https://www.jove.com/t/57881/in-situ-measurement-correlation-cell-density-light-emission?language=French

L-Asparagine vs peptone : effets sur la croissance et la bioluminescence

Introduction

Dans de nombreux articles scientifiques portant sur les espèces du genre Photobacterium, l’utilisation de peptone est souvent préférée à celle de la L-Asparagine dans la préparation des milieux de culture.
Afin de comparer l’impact de ces deux composés, nous allons étudier deux colonies d’une même espèce de Photobacterium cultivées dans deux milieux différents.
Ces milieux reprennent la composition décrite dans la page de référence sur les paramètres de culture.

• Le milieu 1 suit exactement cette composition, avec de la L-Asparagine (10g/L).

• Le milieu 2 en diffère uniquement par le remplacement de la L-Asparagine par de la peptone, dans les mêmes proportions (10g/L)

Nous procéderons d’abord à une analyse spectrométrique d’absorption, puis à une analyse de luminescence afin d’évaluer les différences éventuelles de croissance et d’activité métabolique entre les deux conditions.

Protocole:

Nous préparons deux échantillons:

• Dans l'échantillon 1, on introduit 200 µl de culture de bactéries et 10 ml du milieu 1
• Dans l'échantillon 2, on introduit 200 µl de culture de bactéries et 10 ml du milieu 2

Nous introduisons ensuite les échantillons dans des cuves de spectrométrie.

Deux cuves supplémentaires, contenant respectivement uniquement le milieu 1 et uniquement le milieu 2, servent de blancs pour les mesures d’absorbance de leur échantillon associé.

L’heure d’inoculation est notée, et des mesures d’absorbance sont réalisées toutes les heures, à partir de 1 heure après l’inoculation.

Résultats:

On note :

• A₁ : l’absorbance de l’échantillon 1 (milieu avec L-Asparagine)

• A₂ : l’absorbance de l’échantillon 2 (milieu avec peptone)

Temps (heures)	A₁ (UA)	A₂ (UA)
1	0.118	0.094
2	0.151	0.146
3	0.206	0.216
5	0.367	0.464
6	0.417	0.565
7	0.452	0.608
8	0.481	0.663

 

Pour la facilité de lecture, les données sont tracées sur le graphe suivant:

Intensité de bioluminescence après 7h:

La mesure à été faite sur le luminomètre Berthold Sirius FB12. Nous faisons les mesures à 3 reprises pour chaque échantillon:

• Sans dilution
• Dilué au 10e
  

A blanc, on obtient une valeur autour de 21 RLU/s.

Les échantillons non dilués provoquent un overload de l'appareil, d'où la nécessité de faire des échantillons dilués.

Pour les échantillons dilués au 10e, nous obtenons les valeurs suivantes:

• L'échantillon 1 (L-Asparagine) :  1,961,614 RLU/s
• L'échantillon 2 (Peptone) :  3,247,180 RLU/s