Bactérie bioluminescente Bactérie bioluminescente : Littérature et paramètres de culture. Effet du H2O2 sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie Bibliographie et expérimentation 1) Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) Le peroxyde d'hydrogène une molécule d'eau à laquelle on a ajouté un atome d'oxygène, c'est-à-dire l'eau oxygénée. Cette molécule possède quelques caractéristiques qui en font un bon désinfectant : c'est un produit à grand pouvoir oxydant, ce qui le rend très réactif face à la matière organique, et ce qui lui donne un vaste spectre d'activité vis à vis des micro-organismes : il a un bon pouvoir bactéricide, virucide, et même sporicide. on mécanisme d'action consiste en l'oxydation des groupes sulfhydriles et des doubles liaisons des enzymes des bactéries, en provoquant une modification de la conformation des protéines formant ces enzymes, avec la perte de leur fonction, et par conséquent, la mort cellulaire. 2) La luciférase bactérienne et stress oxydatif. Ce type de réaction nécessite 4 composés : la luciférase bactérienne ; la flavine mononucléotide réduite ou FMNH2 qui sert de luciférine ; un aldéhyde utilisé comme cofacteur RCHO (en biochimie, un cofacteur est une substance chimique non protéique, mais qui est nécessaire à l'activité biologique de celle-ci) ; et l’oxygène moléculaire O2. La luciférase bactérienne est sensible au stress oxydatif. En relisant la bibliographie, nous acons vu que des concentrations en H2O2 ont été utilisés pour voir l'intensité de la bioluminescence. En effet des concentrations de H2O2 ont été utilisés de 50 µM, 100 µM et 250 µM. 3 ) Protocole Expérimental Pour réaliser cette expérience,  j'ai lancé 5 cultures bactériennes avec 200µL de la suspension mère de bactérie bioluminescente et 10mL de milieu classique. J'ai transféré 2mL de cette culture dans des cuves de spectro. J'ai ensuite fait des mesures de DO de cette culture au bout de 1h d'incubation. Après la lecture de la DO j'ai ajouté le H202 aux concentrations voulus dans les cuves. j'ai préalablement dilué au 1/1000ème dans un erlenmeyer pour avoir une concentration de 8,79mM. Puis j'ai ajouté 11µL, 22µL et 55µL dans les cuves de spectro pour être à 50µM, 100µM et 250µM. et j'ai mesuré les DO toutes les heures. DO Témoin 1 DO témoin 2 DO avec 50µM DO avec100µM DO avec 250µM DO 1h= 0,091 DO 1h= 0,071 DO 1h= 0,081 DO 1h= 0,087 DO 1h= 0,086 DO 2h= 0,100 DO 2h= 0,095 DO 2h= 0,093 DO 2h= 0,090 DO 2h= 0,087 DO 3h= / DO 3h= / DO 3h= / DO 3h= / DO 3h= / DO 4h= 0,163 DO 4h= 0,161 DO 4h= 0,161 DO 4h= 0,158 DO 4h= 0,143 DO 5h= 0,252 DO 5h= 0,246 DO 5h= 0,234 DO 5h= 0,229 DO 5h= 0,207 DO 6h= 0,362 DO 6h= 0,364 DO 6h= 0,341 DO 6h= 0,326 DO 6h= 0,301 DO 7h= 0,475 DO 7h= 0,466 DO 7h= 0,46 DO 7h= 0,45 DO 7h= 0,433 Série 1: Témoin sans H202   Série 2 : Témoin sans H202   Série 3: 50µM de H202   Série 4 : 100µM de H202 Série 5: 250 µM de H202 On observe que le H202 a une influence sur la croissance de la bactérie. En effet, la DO baisse en fonction de la concentration du H2O2. A ces concentrations, le H2O2 ne tue pas la bactérie mais ralenti sa croissance. Cependant, nous n'avons pas observé de différences sur la bioluminescence de la bactérie. Je pense que l'enzyme a besoin d'un cofacteur (FMN) pour pouvoir réagir à l'oxyfation du H2O2. C'est une réaction d'oxydo-réduction. Effet de l'asparagine sur la bioluminescence Asparagine Informations Alan KERNANEC, Steve HUBERT alan.kernanec@sorbonne-universite.fr ; steve.hubert@sorbonne-universite.fr FabManagers espace Biologie/Chimie 10/2023 Contexte Afin de tenter de réduire le coût de revient d'un milieu de culture spécifique à une souche de bactérie bioluminescent nous avons cherché à optimiser la quantité des certains constituants. La 1ère publication du protocole de culture datant des années 1910 (La Vie et la Lumière ; Raphaël Dubois ; Félix Alcan Paris, 1914), certains produits sont disponibles avec un niveau de pureté non accessible à l'époque qui justifie de nouveaux essais. Nous nous sommes penchés en particulier sur un acide aminé de ce milieu qui représente à lui seul près de la moitié du coût final : l'asparagine. Objectifs Tester des milieux à différentes concentrations décroissantes d'aparagine pour déterminer jusqu'où il est possible de réduire tout en maintenant la bioluminescence optimum. En réalité il est probable que seule la L-asparagine soit utilisable par les organismes bioluminescents, la D-asparagine restant inutilisée dans le milieu. Or dans les années 1910 si l'asparagine était déjà disponible avec un très bon niveau de pureté, il n'est pas précisé si la différence était faite entre ses deux formes enantiomères. L'optimisation peut être envisagée de ce côté. Consommables souche de cellules bioluminescente yeast exctract (0,75g) glycérol (0,75mL) asparagine (1g) NaCl (7,5g) eau distillée 250 mL divers (aluminium, coupelles de pesée, anses...) Matériel et Machines utilisés erlenmeyer de 25 mL (x14), erlenmeyer 250 mL (x2) autoclave de paillasse (cycle 121°C/20min) balance de précision papier pH pipetman 200µL, 1000µL Protocole Nous allons tester 4 concentrations différentes soit de 4 séries de triplicats (12 échantillons) suivis sur 48h. 1/Préparation et stérilisation de 2 solutions-mères : -1 erlenmeyer contenant 100 mL à 10g.L-1 de L-asparagine -1 erlenmeyer contenant 150mL à 0g.L-1 de L-asparaigne Observation : Avec les concentrations de 0 ; 2,5 ; 5 ; 10 et 2 témoins Date 12/10/23 à 9h30 13/10/23 à 9h45 14/10/23 à 9h30 Par la suite, nous avons fait un autre dosage avec les concentration de 0 ; 0,5 ; 1 et 2,5 Date 17/10/23 à 12h30 17/10/23 à 17h 18/10/23 à 9h30 Résultats : L'effet du NaCl sur la croissance et la bioluminescence de la bactérie Expérimentation                     1) Protocole expérimental. J'ai mesuré la densité optique (DO) avec le spectrophotomètre à 600nm pour évaluer l'évolution de la croissance microbienne den fonction du sel. j'ai donc utilisé deux types de sels : Le NaCl pur (99,5%) Le sel marin Instant ocean. ( 85% de NaCl) J'ai donc mis 200 µL d'une suspension mère de la souche de photobactéries Rattail  bioluminescente et 10mL de bouillon de culture avec du NaCL et avec du sel marin pour comparer l'efficacité de ces deux milieux de culture. J'ai ensuite mesuré la DO toutes les heures. On a utilisé des cuves en polystyrène et le spectrophotomètre biochrom portable. On a fait le blanc avec les milieux et on a mesuré la DO des bactéries toutes les heures. 2) Résultats Temps (heure) DO sel marin DO NaCl 1 0,030 0,014 3 0,082 0,042 4 0,164 0,081 5 0,247 0,147 6 0,303 0,194 7 0,368 0,267 8 0,457 0,316 Tableau 1: Mesure de la DO le 17/04/2025 en partant de la suspension mère de 42h d'incubation. Temps (heure) DO sel marin DO NaCl 1 0,022 0,017 2 0,054 0,030 4 0,154 0,082 5 0,210 0,134 6 0,240 0,170 7 0,301 0,221 Tableau 2 : Mesure de la DO le 18/04/2025 en partant de la suspension mère de 66h d'incubation. 3) Discussion 3.1) Croissance microbienne On observe que la DO est plus élevée avec le sel marin ce qui indique que ce sel est plus favorable à la croissance de la bactérie que le NaCl pur. Le sel marin est riche en différents sels minéraux (figure 1) ce qui doit être plus favorable à la croissance microbienne. En traçant la courbe sur Excel , on obtient une droite sans mettre les valeurs en logarithme.  Le temps de génération de la bactérie est plus longue qu'une 1h  il faudrait donc mesurer les DO toutes les 2h pour pouvoir tracer une courbe de croissance.        Figure : 1 composition du sel marin 3.2) Bioluminescence J'ai comparé l'intensité de bioluminescence. à 4h on commence à voir une bioluminescence mais qui est pale. on atteint le maximum de la bioluminescence au bout de 7h. Au bout de 17h, on remarque une intensité de bioluminescence plus importante avec le NaCl qu'avec le sel marin mais la différence est moins visible après 7h d'incubation.  Il n'y a pas de corrélation entre croissance et bioluminescence. En effet, quand la DO est plus élevée en présence avec le sel marin qu'avec le NaCl alors qu'à l'inverse la bioluminescence est plus élevée en présence de NaCl. On rappel que le sel marin est à 85% de NaCl là ou le NaCl en poudre est à 99,5% de pureté.                      Figure 2  :  Bioluminescence de Rattail sur milieu solide (17h).       Figure 3 : Bioluminescence de de Rattail sur milieu liquide (17h).                                                                                        Figure 4:   Bioluminescence de Rattail sur milieu liquide (7h). Expérimentation 2 1) Protocole expérimental J'ai lancé deux cultures de bactérie : 200µL de bactéries + 10mL de milieu classique 200 µL de la suspension bactérienne + 10mL de milieu avec du NaCl J'ai mesuré la DO toutes les heures à 600nm au spectrophotomètre portable biochrom. 2) Résultats DO avec le Nacl DO avec le sel marin DO 1h= 0,067 DO 1h=0,084 DO 2h= 0,079 DO 2h= 0,100 DO 3h= 0,094 DO 3h= 0,124 DO 4h= 0,131 DO 4h= 0,156 DO 5h= 0,190 DO 5h= 0,230 DO 6h= 0,272 DO 6h= 0,326 DO 7h= 0,363 DO 7h= 0,470 3) Discussion La tendance se confirme. Le NaCl ralenti la croissance de la bactérie. Cependant, on observe que la bactérie a une intensité de bioluminescence plus élevée en présence de NaCl. On peut supposer que le Nacl a 99% de pureté induit un stress à la bactérie ce qui doit augmenter l'activité de la luciférase bactérienne. Expérimentation 3 1) Bibliographie Des chercheurs malaisiens ont testé des concentrations de NaCl sur la bactérie photobacterium sp. Ils ont mesurés la bioluminescence de la bactérie en fonction de différentes concentrations de NaCl : 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L, 40 gl/L et 50g/L . 2) Protocole expérimental J'ai préparer des milieux classiques aux concentration de NaCl de 10g/L, 20g/L, 30 g/l et 40g/L. Ces milieux ont été autoclavés. J'ai ensuite préparé 5 petits erlenmeyer dans lequel j'ai mis 200 µL de suspension bactérienne dans 10 mL de milieu. J'ai également lancé une culture avec 10ml de milieu sel marin et 200µL de suspension bactérienne. 3) Résultats Figure 1: la bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration en Nacl Le milieu utilisé Intensité de la bioluminescence Nacl 10g/L 0 Sel marin + NaCl 20g/L + NaCl 30g/L +++ NaCl 40g/L +++ 4) Discussion Nous avons obtenu des résultats différentes de la littérature. En effet, à 10g/L nous obtenons aucune bioluminescence. En revanche à 40g/L, la bioluminescence est très élevée contrairement à la littérature où ils ont obtenus aucune bioluminescence. Ces différences peuvent s'expliquer par le fait que nous ne manipulons pas la même espèce de photobactrium que dans la littérature et que la composition du milieu utilisé dans la littérature est différente. L'effet de la tryptone sur la croissance et la bioluminescence. Expérimentation 1 1) Bibliographie 3) Résultats                                           Figure 1: Bioluminescence de Rattail en fonction du tryptone                     Figure 2 : Les cultures de Rattail en fonction du tryptone Milieu utilisé Bioluminescence Sans tryptone + Tryptone 20g/L ++ Tryptone 30g/L +++ Tryptone 40g/L +++ Tryptone 50g/L +++ 4) Discussion On observe une forte bioluminescence à partir de 30g/L de tryptone ce qui concorde avec ce qu'il y a dans la littérature. Sans tryptone, on observe une bioluminescence qui est nettement moins élevée. Le tryptone est donc nécessaire au bon fonctionnement de la luciférase bactérienne. Un milieu enrichi en tryptone (≈ 5 g/L), combiné à du glycerol (3 g/L), yeast extract (5 g/L) et NaCl (30 g/L) favorise une croissance efficace de P. phosphoreum T3 et Q67, atteignant respectivement OD ≈ 0,85 et 1,25 en 12 h à 22 °C sciencedirect.com+11pmc.ncbi.nlm.nih.gov+11mdpi.com+11. Des formulations utilisant 1 g/L de peptone (souvent à base de tryptone) avec 20–30 g/L NaCl, glycerol et yeast extract assurent aussi une croissance stable et soutenue, dans le cadre de milieux optimisés pour la bioluminescence. Effet sur la bioluminescence Un milieu complet contenant tryptone stimule la lumière : après 12 h, P. phosphoreum T3 atteint ~6,5×10⁷ RLU ; Q67 ~2,7×10⁶ RLU journals.asm.org+7pmc.ncbi.nlm.nih.gov+7mdpi.com+7. Dans le milieu modifié dit “Boss medium” (contenu en peptone/tryptone), la luminescence est maximale à pH 7,0, avec peptone 1 g/L, yeast extract 1 g/L, NaCl 20 g/L, glycerol 2,5 g/L et atteint un signal RLU stable (~13 600 en continu pendant >120 h) researchgate.net+1mdpi.com+1. La mesure de la bioluminescence de la bactérie avec le luminomètre. Bioluminescence en fonction de chaque paramètre 1) Protocole expérimental On a lancé des cultures avec la suspension mère du 09/05/2025 Pour ce faire on a mis : 200µL de la suspension mère dans 10mL de milieu.               On a laissé incuber les cultures 16h à température ambiante dans la réserve. On a ensuite transféré 250µL dans les puits des microplaques. On a ensuite mesuré la bioluminescence exprimé en RLU ( Relative light unit) avec le lecteur de plaque luminomètre BertholdTech TriStar2S.                                        2) Résultats Echantillon Mesure 1 (RLU) Mesure 2 (RLU) Mesure 3 (RLU) moyenne Sel marin 44845504 46015056 46768168 45 876 243 NaCl 10g/L 235183 112455 1790293 712643,6667 NaCl 20 g/L 60977620 60070600 58558968 59869062,67 NaCl 30 g/L Overload Overload Overload NaCl 40 g/L Overload Overload Overload                                                                          Figure 1 : La bioluminescence en fonction de la concentration de la NaCl Echantillon Mesure 1 (RLU) Mesure 2 (RLU) Mesure 3 (RLU) moyenne Sans glycérol 33247172 32239560 33735476 33074069,33 Glycérol 3g/L 42860224 42131648 40296944 41762938,67 Glycérol 4g/L 45816200 45822756 47212044 46283666,67 Glycérol 5g/L 30895180 31607086 32870984 31791083,33 Glycérol 6g/L 46946548 43893304 43641736 44827196                                                                           Figure 2 : La bioluminescence en fonction de la concentration du glycérol Echantillon Mesure 1 (RLU) Mesure 2 (RLU) Mesure 3 (RLU) moyenne Sans asparagine 32419202 35136032 31284540 32946591,33 Asparagine 20g/L Overload Overload Overload Overload Asparagine 30g/L 62468408 58194472 59331008 59997962,67 Asparagine 40g/L Overload Overload Overload Overload Asparagine 50g/L Overload 62883208 49083528 /                                                                     Figure 3 : La bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration en asparagine Echantillon Mesure 1 (RLU) Mesure 2 (RLU) Mesure 3 (RLU) moyenne Sans tryptone 31655116 32114984 30762482 31510860,67 Tryptone 20g/L 39209212 39168668 43397976 40591952 Tryptone 30g/L 51469600 57521668 57203196 55398154,67 Tryptone 40g/L 44447328 47998668 47332372 46592789,33 Tryptone 50g/L 42574080 43918224 40970844 42487716                                                              Figure 4 : La bioluminescence de la bactérie en fonction de la concentration de tryptone. 3) Discussion Nous avons obtenu des valeurs globalement très élevé en URL ( de l'ordre de 10^7 URL) alors que dans la littérature c'est dans l'ordre de 10^6 . Il faut préalablement dilué nos échantillons et mettre un volume plus petit (150-200µL) pour pouvoir quantifier la bioluminescence et éviter la surcharge. De plus, il faut faire un témoins négatif (eau distillé) pour avoir une valeur de référence sans bioluminescence. les conditions favorables pour la bioluminescence de la bactérie c'est 20g/L d'asparagine, 30gl/L de NaCl, 30g/L de tryptone et 4g/L de glycérol ce qui correspond à ce que l'on voit dans la littérature. Pour le NaCl, on observe qu'à 10g/L, il n'y a aucune bioluminescence mais à partir de 20g/L, la bioluminescence est plus élevée qu'avec le sel marin . Pour le glycérol , il semblerait qu'une concentration à 4g/L et légèrement plus favorable à la bioluminescence qu'à 3g/L. Nous avons observé préalablement qu'entre 0 et 10g/L d'asparagine, il n'y a pas d'influence sur la bioluminescence. En revanche, 20g/L d'asparagine suffit pour voir une intensité nettement plus élevée de la bioluminescence. In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes L'exposition prolongée à l'O₂ génère des radicaux libres inhibant la luminescence. L'ajout d'antioxydants (ex: ascorbate) ou l'expression de superoxyde dismutase (sodA) prolonge la durée de luminescence de 40% 3. Tableau 2 : Impact des nutriments sur la luminescence Composé Rôle Effet sur la luminescence Glycérol (0,5%) Source carbone facilement métabolisable Augmentation de 45% Extrait de levure Fournit précurseurs de flavines Augmentation de 30% NaCl (3%) Maintient l'homéostasie ionique marine Essentiel pour Vibrio spp. https://www.jove.com/t/57881/in-situ-measurement-correlation-cell-density-light-emission?language=FrenchL-Asparagine vs peptone : effets sur la croissance et la bioluminescence