# Culture de Dunaliella
Mortain‐Bertrand, Anne, et al. « A METHOD FOR THE CRYOCONSERVATION OF *DUNALIELLA SALINA* (CHLOROPHYCEAE): EFFECT OF GLYCEROL AND COLD ADAPTATION1 ». *Journal of Phycology*, vol. 32, no 2, avril 1996, p. 346‑52. *DOI.org (Crossref)*,
[https://doi.org/10.1111/j.0022-3646.1996.00346.x](https://doi.org/10.1111/j.0022-3646.1996.00346.x).
Source: Chat GPT et article
Voici un **protocole détaillé de cryoconservation de *Dunaliella salina*** en laboratoire, adapté aux moyens standards (congélation à -80 °C ou azote liquide si disponible).
---
## 🧪 Protocole de cryoconservation de *Dunaliella salina* ### 📋 Matériel nécessaire
- Culture saine et exponentielle de *D. salina* - Milieu de culture (ex. : F/2 ou Johnson avec 20–25 % NaCl) - **Cryoprotecteur** : Glycérol (10 %) ou DMSO (5–10 %) - Tubes cryogéniques stériles (1,8 ou 2 mL) - Glace ou bain de refroidissement (alcool + glace carbonique) - Congélateur à -80 °C ou cuve d’azote liquide (-196 °C) - Pipettes stériles - Boîte isotherme si transport entre étapes ---
### 🔬 Étapes du protocole #### **1. Préparation de la culture**
- Prélever une culture saine de *Dunaliella salina* en phase exponentielle (dense, bien verte/rosée selon la souche). - Centrifuger doucement si nécessaire (ex. : 2500 g, 5 min) pour concentrer la biomasse, puis resuspendre dans un volume réduit de milieu.
#### **2. Ajout du cryoprotecteur**
- Mélanger le cryoprotecteur au milieu de culture : - **Exemple** : 900 µL de culture + 100 µL de glycérol pur (pour atteindre 10 %) - Bien homogénéiser (éviter la formation de bulles).
💡 *Travailler rapidement pour éviter un choc osmotique prolongé.*
---
#### **3. Aliquotage**
- Distribuer dans des tubes cryogéniques stériles (1,5 à 2 mL max/tube). - Fermer hermétiquement. ---
#### **4. Refroidissement progressif**
- Placer les tubes dans un système de refroidissement contrôlé : - Idéal : **boîte de congélation progressive** (ex. : Nalgene™ Mr. Frosty) → -1 °C/min - Alternatif : refroidir les tubes dans un bloc de polystyrène au congélateur -80 °C pendant 2–4 h ---
#### **5. Stockage**
- Une fois à -80 °C, transférer : - Soit dans un congélateur -80 °C (conservation correcte jusqu’à 2–3 ans) - Soit dans de l’azote liquide pour stockage long terme (>10 ans) ---
### 🌱 Décongélation et reprise
1. Sortir le tube et le **plonger rapidement dans un bain-marie à 37 °C** (30–60 s). 2. Dès que la glace est fondue, transférer immédiatement dans un tube contenant du milieu frais à température ambiante. 3. Laisser se réacclimater à la lumière faible et température douce (20–25 °C) pendant quelques jours. 4. Observer la reprise de la croissance (microscopie ou turbidité visuelle). ---
### ✅ Notes importantes
- Toujours **étiqueter clairement** chaque tube (nom de souche, date, cryoprotecteur utilisé). - Ne jamais recongeler un échantillon déjà décongelé. - Pour chaque souche, garder **au moins 3 tubes de secours**.