Protocole d'extraction de l'ADN

1) Préparation du tampon d'extraction: Préchauffer le tampon CTAB dans le bain-marie a 60°C .

2) Préparation de l'échantillon : Broyer les feuilles d'haricots  jusqu'à obtenir une poudre fine. 

3) Ajout du tampon CTAB : 

• Ajouter 7,5 mL de CTAB par gramme de feuille broyé.

4) Ajout des réactifs : 

• Sous hotte il faut ajouter 10 à15 Mg de charbon actif par gramme de feuille
• 375µL de B- mercaptoéthanol par gramme de feuille
• Bien vortexer 

5) Incubation : 

• Incuber à 65°C pendant 1h avec agitation

6) Extraction avec solvant : 

• Ajouter 7,5 mL d'un mélange chloroforme : Alcool isoamylique par gramme de feuille
• Mélanger doucement en inversant les tubes pendant 5 minutes. 

7) Centrifugation à 16300 g pendant 10 minutes à 4°C et le répéter si nécessaire pour clarifier la phase aqueuse. 

8) Précipitation de l'ADN :

• Récupérer le surnageant : Ajouter 2/3 de volume d'isopropanol froid à 4°C
•  Inverser doucement et laisser précipiter au moins 30 minutes à - 20°C 

9) Centrifugation de l'ADN : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C. 

10) Eliminer le surnageant : Jeter le surnageant délicatement sans toucher le culot. 

11) Lavage de l'ADN: 

• Ajouter 10 mL de tampon de lavage par gramme de feuilles
• Agiter verticalement pendant 30 minutes 

12) Nouvelle centrifugation : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C.

13) Séchage de l'ADN : Jeter le surnageant et laisser sécher à l'air libre pendant 20 minutes. 

14) Solubiliser l'ADN : Ajouter 100µL-300µL  de TE 1X pour suspendre le culot. 

15) Incubation : Chauffer à 60°C  pendant 10 minutes. 

16) Dégradation de l'ARN : 

• Ajouter 8µL de RNase pour 100µL d'ADN
• Incuber à 37°C  pendant 30 minutes 

17) (optionnel ) : Clarification finale: Centrifuger à 650 g pendant  2 minutes.