Protocole d'extraction de l'ADN

1) Préparation du tampon d'extraction: Préchauffer le tampon CTAB dans le bain-marie a 60°C .
2) Préparation de l'échantillon : Broyer les feuilles d'haricots  jusqu'à obtenir une poudre fine.

3) Ajout du tampon CTAB :

Ajouter 7,5 mL de CTAB par gramme de feuille broyé.

4) Ajout des réactifs :

Sous hotte il faut ajouter 10 à15 Mg de charbon actif par gramme de feuille
375µL de B- mercaptoéthanol par gramme de feuille
Bien vortexer

5) Incubation :

Incuber à 65°C pendant 1h avec agitation

6) Extraction avec solvant :

Ajouter 7,5 mL d'un mélange chloroforme : Alcool isoamylique par gramme de feuille
Mélanger doucement en inversant les tubes pendant 5 minutes.

7) Centrifugation à 16300 g pendant 10 minutes à 4°C et le répéter si nécessaire pour clarifier la phase aqueuse.

8) Précipitation de l'ADN :

Récupérer le surnageant : Ajouter 2/3 de volume d'isopropanol froid à 4°C

Inverser doucement et laisser précipiter au moins 30 minutes à - 20°C

9) Centrifugation de l'ADN : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C.

10) Eliminer le surnageant : Jeter le surnageant délicatement sans toucher le culot.

11) Lavage de l'ADN:

Ajouter 10 mL de tampon de lavage par gramme de feuilles
Agiter verticalement pendant 30 minutes

12) Nouvelle centrifugation : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C.
13) Séchage de l'ADN : Jeter le surnageant et laisser sécher à l'air libre pendant 20 minutes.

14) Solubiliser l'ADN : Ajouter 100µL-300µL  de TE 1X pour suspendre le culot.

15) Incubation : Chauffer à 60°C  pendant 10 minutes.

16) Dégradation de l'ARN :

Ajouter 8µL de RNase pour 100µL d'ADN
Incuber à 37°C  pendant 30 minutes

17) (optionnel ) : Clarification finale: Centrifuger à 650 g pendant  2 minutes.