Illumina Miseq sequençage d'ADN

PRINCIPE
Illumina Miseq utilise le séquençage par synthèse avec détection optique ( SBS =  "Sequencing by synthesis"). Cet appareil permet d'analyser les données ADN en seulement huit heures. Le système MiSeq regroupe la génération d’amplifiats, le séquençage et l’analyse des données en un seul instrument. Le processus permet d'identifier simultanément les bases d'ADN lorsqu'elles sont incorporées dans la chaîne d'acide nucléique. Chaque base émet un signal de fluorescence unique lorsqu'elle est ajoutée au brin en cours de synthèse, ceci est utilisé pour déterminer la séquence d'ADN.
APPLICATIONS

Re-séquençage
Séquençage de novo de petits génomes
Séquençage de produits PCR

CARACTERISTIQUES

Longueur des séquences attendues : jusqu’à 300 pb (2 x 300 pb en paired-ends)
15Gb / flowcell (2 x 300 pb en paired-end)
Moins de 2% d’erreur sur les séquences alignées sur le génome de contrôle (PhiX)
1 flowcell de 1 lane
Possibilité de multiplexage (jusqu’à 288 index en séquençage de produits PCR, 24 à 48 index pour le séquençage d’ADN génomique)
55 heures pour un run de séquençage en paired-end 2×300 pb

Fonctionnalités
-Automatisation autonome : après la configuration de l’analyse, qui comprend le chargement d’unecartouche de réactifs pré-remplie, du flacon de tampon et de la Flow Cell, aucun temps de manipulationsupplémentaire n’est requis.-Cartouche de réactifs pré-remplie : une cartouche de réactifs pré-remplie à usage unique etspécialement conçue pour fournir les réactifs pour la génération d’amplifiats et le séquençage, y comprisles réactifs de séquençage à lectures appariées et les réactifs d’indexage. Le suivi d’identification parradiofréquence (RFID) intégré permet un suivi fiable des consommables.-Commandes de l’interface : l’interface du logiciel de commande MiSeq (MCS) comporte lesfonctionnalités de configuration de l’instrument, de configuration et de surveillance des analyses et deréalisation des procédures de maintenance.-Chargement pratique des Flow Cell : un mécanisme de pince positionne automatiquement les Flow Celllors de leur chargement dans l’instrument. Le suivi d’identification par radiofréquence (RFID) intégrépermet un suivi fiable des consommables.-Architecture de fluidique novatrice : le système fluidique MiSeq procure une efficacité inégalée de ladurée du cycle chimique pendant le séquençage.-Real-Time Analysis (RTA) : le logiciel d’analyse intégré analyse les données sur l’instrument en temps réelpendant l’analyse de séquençage, ce qui comprend l’analyse d’images et l’appel de bases, et permetd’économiser un temps d’analyse précieux en aval.-Local Run Manager : le logiciel d’analyse secondaire intégré traite les données à partir de l’analyse RTApour procéder à l’alignement et fournit des renseignements sur chaque échantillon analysé.
Composants
Le système MiSeq comprend un écran tactile, une barre d’état, un bouton d’alimentation avecports USB adjacents et trois compartiments.

A Compartiment de Flow Cell : contient la platine qui accueille la Flow Cell pendant l’analyse. Les moteurs de laplatine extraient la platine du module optique joint pour le chargement de la Flow Cell et la réinsèrent dans lemodule lorsque l’analyse commence.B Compartiment optique joint : contient les composants optiques qui permettent l’imagerie de la Flow Cell.C Barre d’état : indique que la Flow Cell est prête pour le séquençage (vert), en traitement (bleu) ou qu’ellenécessite une intervention (orange).D Écran tactile : affiche l’interface du logiciel de commande pour la configuration du système et des analyses.E Ports USB externes : facilitent le transfert de fichiers et de données sur l’ordinateur de l’instrument à partir del’écran de surveillance tactile.F Compartiment des réactifs : contient les réactifs à la bonne température, les solutions de lavage et le flacon àréactifs usagés. Un verrou magnétique sécurise la porte du compartiment des réactifs.L’interface MiSeq vous guide tout au long du processus de configuration de lʼanalyse grâce à lʼécran de surveillance tactile. Le chargement des composants de l’analyse nécessite d’accéder au compartiment des réactifs et au compartiment de Flow Cell.
Compartiment de Flow CellCe compartiment contient la platine de la Flow Cell, la station thermique et les connexions fluidiques vers laFlow Cell. La platine de la Flow Cell maintient la Flow Cell. La pince de Flow Cell fixe et positionne la Flow Cell.Lorsque la pince de Flow Cell se ferme, deux broches à proximité de sa charnière positionnentautomatiquement la Flow Cell.La station thermique, située sous la platine de la Flow Cell, surveille les modifications de température de laFlow Cell nécessaires à la génération d’amplifiats et au séquençage.

Logiciels du système
La suite logicielle de l’instrument comprend des applications intégrées qui exécutent des analyses deséquençage, des analyses sur instrument et des fonctions connexes.-Logiciel de commande MiSeq (MCS) : commande le fonctionnement de l’instrument. L’interface dulogiciel de commande MCS vous guidera tout au long des étapes de chargement de la Flow Cell et desréactifs avant le lancement de l’analyse. Un aperçu des statistiques de qualité s’affiche pendant laprogression de l’analyse.-Lors de l’analyse, MCS gère la platine de la Flow Cell, distribue les réactifs, commande la température dela Flow Cell et capture les images des amplifiats sur la Flow Cell. MCS exécute l’analyse selon lesparamètres indiqués dans le logiciel Local Run Manager.-Logiciel Real-Time Analysis (RTA) : exécute les analyses d’images et la définition des bases tout enaffectant un score de qualité à chacune des bases, pour chacun des cycles. Les images sonttemporairement stockées dans le dossier d’analyse pour leur traitement par RTA, puis automatiquementsupprimées à la fin de l’analyse RTA.-Local Run Manager : une solution intégrée sur instrument, destinée à la création d’analyses, à lasurveillance de l’état des analyses, à l’analyse des données de séquençage et à l’affichage des résultats.Local Run Manager fait également le suivi des données sur les échantillons et sert au contrôle desautorisations des utilisateurs. Le logiciel s’exécute comme un service Windows sur l’ordinateur del’instrument et s’affiche dans un navigateur Web. Des logiciels facultatifs sont également utilisés hors de l’instrument, notamment le visualiseur d’analyse deséquençage (Sequencing Analysis Viewer, ou SAV).
Icones d'état

Une icône d’état dans l’interface du logiciel de commande indique un changement de conditions pendant la configuration de l’analyse ou en cours d’analyse. Les chiffres affichés sur l’icône indiquent le nombre de points à signaler dans chaque cas.

Lorsque l’état de l’analyse change, l’icône clignote pour vous en avertir. Sélectionnez l’icône pour afficher une description de la situation. Sélectionnez Acknowledge (Accepter) pour effacer le message, puis Close (Fermer) pour fermer la boîte de dialogue.
Filtrez les types de message à afficher dans la fenêtre d’état en sélectionnant les icônes dans la marge supérieure de la fenêtre. En sélectionnant une icône, vous activez ou désactivez son affichage.

indicateurs d'activité:
Une icône indique l’activité que l’instrument est en train de traiter
De gauche à droite, les indicateurs d’activité représentent les activités suivantes :

Déplacement de la platine Y
Déplacement de la platine Z
Activation de la fonctionnalité électronique
Utilisation de la caméra
Pompage par le système fluidique

indicateurs de capteurs:
Les indicateurs de capteurs au bas de chaque écran de l’interface montrent l’état des composants del’instrument

De gauche à droite, les indicateurs de capteurs représentent les composants suivants :

Porte du compartiment de la Flow Cell, fermée ou ouverte

Température du réfrigérant pour réactifs en °C
Température de la Flow Cell en °C
Statut de la connexion BaseSpaceMD (non connecté sur l’illustration)

Flow cell
La Flow Cell MiSeq est un substrat de verre à usage unique qui sert de support à la génération des amplifiats et à la réaction de séquençage.Les réactifs pénètrent dans la Flow Cell par le port d’entrée, traversent la zone d’imagerie de la ligne unique, puis sortent par le port de sortie. Les déchets qui sortent de la Flow Cell sont transférés dans le flacon à déchets.Les librairies sont chargées sur la cartouche de réactifs avant la configuration de l’analyse et sont automatiquement transférées à la Flow Cell après le lancement.

FONCTIONNEMENT
Démarrage de l’instrument MiSeq
1) Mettez l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’instrument en position | (Marche).REMARQUE: Laissez l’instrument allumé en permanence pour des performances optimales. Toutefois, si vous devezéteindre l’instrument, consultez la section Arrêt de l’instrument, page 44. Attendez au moins60 secondes avant de rallumer l’appareil.

2) Attendez que le système se charge, puis connectez-vous au système d’exploitation. Si nécessaire,consultez l’administrateur de votre établissement pour obtenir le nom d’utilisateur et le mot de passe.Une fois le système d’exploitation chargé, le logiciel de commande MiSeq (MCS) est lancé et le systèmes’initialise automatiquement.3) Pour Local Run Manager, si la gestion des utilisateurs est activée, connectez-vous à l’aide de votre nomd’utilisateur et de votre mot de passe Local Run Manager, puis sélectionnez Next (Suivant).
BIBLIOGRAPHIE
Manuel d'utilisation complet de la machine : https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/translations/miseq-system-guide-for-windows-7-1000000154717-fra.pdf
Guide préparation de l'installation de l'appareil : https://emea.support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-site-prep-guide-15027615-01.pdf
Manuel d'utilisation pour charger ses propres amorces (Primers) : https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-system-custom-primers-guide-15041638-01.pdf
Article Scientifique sur les techniques de séquençage en comparant deux méthodes sur sphère ( Ion torrent) et sur lame ( Illumina ) : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1877120321000136