🧫 UE 564 démarche expérimentale (Bio)



Quels sont les effets d'une induction d'oestrogène et de progestatif de synthèse sur le comportement et la survie du gammare ?

Le contexte de notre expérience :
L'échec du nano-plastique :
Notre premier sujet ne se concentrait pas sur la pollution des rivières aux hormones sexuelles mais sur la fragmentation du microplastique de polyéthylène en nanoplastique par les gammares de l'Oise. Notre question s'originait dans l'article suivant : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7393071/ Les auteurs remarquent qu'une espèce de gammare : Gammarus duebeni, est capable de fragmenter le microplastique (polyéthylène) en nano plastique. Ce phénomène pose des enjeux environnementaux importants car le nano plastique est toxique et peut s'infiltrer dans les cellules.Après avoir commencé à mettre en place le plan expérimental et fais des recherches sur les gammares (ou les pécher, comment les stocker et les maintenir en vie les temps de l'expérience...) nous avons abordé plusieurs questions pratiques concernant les techniques de mesures de la quantité de plastique à la fin de l'expérience. Ce point a été le premier problème dans la mise en place de notre plan expérimental car nous avions plusieurs idées en théorie (utiliser un filtre à nano ou micro particules, observation après évaporation ou centrifugation), mais dont nous ne connaissons pas l'efficacité. De plus nous n'étions pas sûr d'avoir le matériel nécessaire au greenlab. Pour tester nos techniques, il a fallu produire nous même le microplastique. Pour cela, nous avons découpé à la main le haut de bidons de polyéthylène (que nous réutiliserons plus tard pour notre expérience sur les hormones sexuelles stéroïdiennes) avant de les broyer. Pour faire cela, nous comptions utiliser un ultra-turax, qui fut un échec. N'ayant pas réussi à produire du micro plastique ni à répondre à toutes nos problématiques et ayant déjà perdu du temps, nous avons décidé de modifier notre sujet pour s'intéresser à l'effet d'hormones sexuelles (œstrogène + progestatif de synthèse) sur le comportement d'une population de gammares de l'Oise.
Plan expérimental :
Nous utilisons des pilules contraceptives de concentration de 30 microgrammes d'oestradiol par pilule. La concentration d'œstradiol dans chaque cuve est la variable indépendante de nature quantitative discrète. 3 conditions expérimentales sont testées : - Contrôle : aucune modification des paramètres - Low : Faible concentration d'oestradiol (7,5 microg/L soit 1/2 pilule par cuve) - High : Forte concentration d'oestradiol (75 microg/L soit 10x plus soit 5 pilules par cuve) Chaque condition est répliquée 6 fois, nous avons donc un total de 18 cuves. O utre la concentration d'oestradiol  elles ont toutes les mêmes paramètres :-2L d'eau d'Oise -Oxygénation par bulleur - 6 gammares ( 4 choisis aléatoirement et 1 couple présentant un comportement pré-copulatoire : gammare mâle intelligent au dos d'une femelle) -3 granules broyées de nourriture pour crevette
Les cuves sont disposées de sortes à ce qu'aucune ne soit à côté d'une condition similaire afin de randomiser et d'éviter que les facteurs extérieurs n'influencent uniquement les cuves d'une condition, induits par une fenêtre (lumière et aération ) et une porte (présence humaine)

Nous avons fait un relevé de résultats à 3 reprises, chacune espacées d'une semaine et sans condition modificatrice à part le rajout de nourriture. Cela nous permet d'observer l'évolution de la modification du comportement des gammares au cours du temps. Dates des relevés : 24/11, 01/12, 08/12
Nous observons 3 variables dépendantes  -Survie des gammares (quantitative discrète ) -Temps de comportement pré-copulatoire ( quantitative continue ) -Mobilité ( quantitative discrète )
Protocole :
Préparation de l'expérience :
Pour commencer, nous avons pêché les gammares dans l'Oise à Orry-la-Ville et nous avons récupéré l'eau (18 L pour les cuves + quelques litres en plus pour réaliser les mesures). Nous avons utilisé 18 bidons de polyéthylène de 5L pour en faire des cuves. Pour cela, nous avons coupé le haut. Puis nous avons rempli ces cuves de 2L d'eau de l'Oise chacune et nous les avons disposées (voir schéma du plan expérimental). Afin d'oxygéner les cuves, nous avons réalisé un montage en série avec des bulleurs cylindriques. Les gammares ont été répartis aléatoirement dans les cuves, avec 6 gammares par cuve dont un couple. Nous les avons nourris avec de la crevettes pour nourriture et nous avons ajouté les pilules : une demi pour les cuves condition Low et 5 pour les cuves condition High.

Afin qu'elles puissent être réduites dans l'eau des cuves, nous avons broyés chacune de pilules en fine poudre à l'aide d'un mortier que nous avons rincé à l'eau claire entre chaque cuve.
Pilules contraceptives pour la condition High, avant et après broyage par un mortier
Mesures :
Nous avons réalisé les mêmes mesures à trois reprises : le 24 novembre et les 1er et 8 décembre. Nous avons à chaque fois compté le nombre de gammares morts par cuves, ainsi que le nombre de couples, c'est-à-dire les gammares qui sont associées ensemble. Pour filmer les déplacements, nous avons utilisé 6 boîtes en verre plastifié de 15×15 cm. Sous ces boîtes, nous avons placé du papier quadrillé avec des carreaux de 1×1 cm (technique provenant de Vellinger et al. 2012). Nous avons rempli les boîtes avec 100 mL d'eau de l'Oise que nous avions en plus. Nous avons transféré les gammares de 6 cuves dans les boîtes, tout en gardant la même répartition que dans les cuves. Nous les avons agités avec une baguette en bois le plus rapidement possible afin qu'ils ont subi les mêmes perturbations puis nous avons attendu 1 minute avant de commencer l'enregistrement. Chaque vidéo dure 1 minute. Nous avons refait la même chose à 2 reprises pour avoir toutes les cuves. Nous avons ensuite regardé les vidéos et compté le nombre de carreaux que chaque gammare traverse en prenant un point de repère sur le corps du gammare.

Dispositif de prise de mesures de la mobilité des gammares pour 6 cuves
Journal de bord :
Rapport du 6/10/2022 et 12/10/2022 - 1ère et 2ème séances en groupe Nous avons défini les enjeux de notre premier plan d'expérience sur la dégradation du micro plastiqué en nano. Nous avons aussi des recherches sur le mode de vie et la biologie des gammares : Les gammares vivent en eau douce pour la plupart des espèces, dans des eaux entre 2 et 20°C. Ils supportent bien les changements de pH (entre 4 et 9,9) et la pollution dans une certaine mesure. En revanche, ils ont besoin d'une eau bien oxygénée. Ils se nourrissent de détritus organiques ou bien inorganiques, dont notamment des feuilles mortes. Les juvéniles peuvent aussi être cannibales s'ils n'ont pas assez de nourriture. La reproduction à lieu toute l'année, chaque femelle peut avoir jusqu'à 6 "portées" par an. Les juvéniles sont la forme majoritaire toute l'année, leur croissance dure 2 à 3 semaines l'été, elle est ralentie en hiver. L'espérance de vie des gammares est entre 1 et 2 ans. La densité est maximale en septembre puis décroît pour atteindre la minimale en février-mars. Cela pose une limite : il ne faut pas trop tarder avant d'aller nous procurer nos gammares. Enfin nous avons déterminé le lieu de pêche : Le lavoir d'Orry-La-Ville en Picardie, alimentées par l'Oise.
Rapport du 20/10/2022 Nous sommes rendus compte que notre expérience était bien trop compliquée à mener avec nos moyens et nos délais, donc nous avons dû modifier notre problématique. Nous avons dépassé la majorité de la séance à réfléchir à de nouvelles problématiques, mais qui pourraient toujours se concentrer sur la pollution aux microplastiques des rivières. Nous avons reçu notre matériel :-18 cuves dans lesquelles nous allons contenir nos gammares-Des bulleurs que nous allons monter en série
Rapport du 27/10/2022 Thomas est allé faire du repérage et récupère des gammares dans le lavoir le matin même. Au Fablab nous avons découpé transversalement le haut de nos 18 cuves, broyer les morceaux de polyéthylène ainsi récupérés, puis grâce à l'ultra turax on créer des micro plastiques entre 20 et 40 microm (pour qu'ils passent dans nos filtres). Malheureusement l'ultra turax n'a pas fonctionné sur nos plastiques. Fautes de moyen nous avons du passer à notre plan de secours et décider d'une autre problématique
Nous nous interessons maintenant à l'effet d'une forte quantité d'œstrogène sur une population de gammares. On en retrouve dans nos rivières à cause de la pollution par le rejet de pilules contraceptives et par nos urines. Chez les poissons, cette hormone entraîne des phénomènes de féminisation. Moins d'études ont été accordées quant à son effet sur les arthropodes mais on peut hypothétiser qu'il y en a et c'est ce que nous allons chercher à prouver.
Rapport du 27/10/2022 Nous nous sommes rendus au greenlab pour vérifier que les gammares péchées par Thomas étaient toujours vivantes. Nous avons observé leur comportement (comportement pré-copulatoire, présence de nouvelles larves, comportement d'accrochages ...) et j'ai testé les protocoles (quelle taille de quadrillage ressort le mieux à la vidéo, plutôt utiliser un quadrillage ou une alerte graduée pour la mesure en hauteur, les vidéos filmées au téléphone sont elles exploitables..)Après tous ces tests, nous avons découvert que l'expérience et la prise et l'analyse de données étaient réalisables.
Rapport du 17/11/2022 Lucie, Thomas et Hugo se sont donnés rendez-vous le matin pour prendre le ter vers la picardie : direction le lavoir ! Nous sommes partis avec 9 bidons de 5L, que nous avons chacun remplis d'eau du lavoir. Cela nous fait donc un total de 45L. Pour remplir nos 18 cuves de 2L il nous faut 36L, ce qui nous laisse 9L de côté pour les rinçages et les mesures.A l'aide  d'épuisettes nous avons péchés les gammares. Ce n'étais pas difficile car une fois que nous retournions les feuilles mortes au fond du lavoir (profondeur de 30cm environ) des gammares par dizaine s'activaient. Il nous fallait un total de 108 gammares pour nos expériences. Afin d'en avoir de côté si il y avait des morts pendant le transport, des parasités etc nous en avons péché environ 160. Nous les avons entreposé dans 4 bidons différents pour éviter les problèmes de densité. Nous devions prendre le ter en fin de matinées pour ramener nos gammares au campus pierre et marie curie, cependant tous les transports ont été interrompus, nous sommes restés bloqués et arrivés sur paris qu'aux environs de 21h. Nous avons entreposés les bidons chez Thomas pour la nuit.
Capture de gammares au lavoir d'Orry-la-ville

Rapport du 18/11/2022Nous avons ramenés les bidons au campus et disposés les gammares dans les 18 cuves. Aucune gammare n'est mort durant le transport (yes !). Nous avons pu lancé le protocole : broyer les pilules et les introduire dans les cuves High et Low. Nous avons aussi nourris nos gammares à l'aide de granules pour crevettes, elles aussi broyées au mortier.
26/11/2022, 01 et 08/12/2022Nous avons fait les mesures de résultats selon le protocole détaillé plus haut
Mois de décembreNous avons analysé les vidéos afin de créer notre jeu de donnée pour les analyses statistiques

TRUCS A SUPP
Notre question s'origine dans l'article suivant : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7393071/ Les auteurs remarquent qu'une espèce de gammare : Gammarus duebeni, est capable de fragmenter le microplastique (polyéthylène) en nano plastique. Ce phénomène pose des enjeux environnementaux importants car le nano plastique est toxique et peut s'infiltrer dans les cellules. La séance du jour nous a permis de poser les principaux enjeux de notre sujet. Gammarus duebeni est une espèce que l'on retrouve plutôt en Irlande et dans une moindre mesure dans les eaux douces britanniques. Nous nous demandons donc si ce phénomène de fragmentation peut se retrouver chez d'autres espèces de gammares en Ile-de-France ou dans les environs.
Pour tester notre hypothèse, nous avons décidé de réaliser une expérience. Bien que pour le moment encore en cours de réflexion, nous réussirons à introduire des gammares dans une cuve d'eau douce et leur donner du microplastique pendant une certaine durée puis doser le nano plastique ou microplastique par la suite. Afin de réaliser notre expérimentation, nous suivrons plusieurs indications dans l'article cité plus haut. Plusieurs problématiques se déclinent de suite : - Les auteurs de l'article indiquent avoir cherché au sein même des organismes la présence de nano plastique, ce qui peut laisser entendre que ces particules restent piégées dans les paroisses digestives des gammares. Ceci est à prendre en compte pour une analyse correcte de nos particules.Nous avons pensé à doser la présence de nano plastique dans l'eau, hors peut-être que nous n'aurons rien si on ne prend pas en compte le fait que le plastique peut encore résider dans les gammares. Pour cela, au moins deux possibilités sont avancées : mesurer microplastique et nano plastique et en faire le rapport afin de voir s'il manque de la matière, ou bien lyser les gammares à la fin de l'expérience pour récupérer le nano plastique (nous n'avons pas encore trouvé comment faire cela). - Il y a une grande diversité de classification du microplastique et nano plastique vis-à-vis des tailles que cela représente. Nous allons surement nous référer à la classification utilisée dans l'article pour nos mesures.- Nous ne connaissons pas la dynamique du micro- et nano plastique dans l'eau, est-ce que cela se sédimente rapidement ? Cela dépend par ailleurs de l'induction ou non d'un courant dans la cuve pour gammares. De plus, on ne sait pas comment le plastique va réagir et s'agréger à la matière organique générée par les gammares.
L'expérience :
Pour notre expérience, nous avons au moins 3 conditions différentes à réaliser : - Contrôle 1 : eau douce sans gammares - Contrôle 2 : eau douce issue du lieu de capture de gammares sans gammares - Condition 1 : eau douce issue du lieu de capture de gammares avec gammares
Le contrôle 2 a pour objectif de vérifier que c'est bien la présence de gammares qui permet la fragmentation du microplastique et non des micro-organismes ou des conditions spécifiques de l'eau. Le contrôle 1 permet de vérifier, dans le cas ou le contrôle 2 et la condition 1 montre toutes deux que le plastique est fragmenté, que l'eau ne permet pas seule de fragmenter le plastique (auquel cas, on montrera alors le rôle prépondérant de l'eau douce issue du lieu de capture de gammares dans le processus de fragmentation). Il pourra exister d'autres hypothèses concernant ce résultat : protocole exp., matériel ou utilisé autre.. Le nombre de réplicats est encore indéterminé, de même que la réalisation dans le temps des manipulations.Selon nos connaissances actuelles, nous pouvons réaliser une condition d'une durée de 4 jours - temps donné par l'article auquel nous nous référons. On peut donc choisir de réaliser toutes les conditions en même temps, sachant que cela peut poser un problème à la fin des 4 jours lorsque nous aurons toutes les manipulations à faire pour doser le plastique.
Dans tous les cas, il nous semble important d'essayer rapidement des manipulations autour du microplastique pour, lorsque l'expérience commencera, être confiant sur la méthode que nous aurons choisie pour le mesurer. Il faut donc prévoir d'acheter du microplastique (polyéthylène ?) rapidement.

Pour la semaine prochaine :
Notre groupe étant composé de 5 personnes, nous sommes répartis les recherches autour du sujet. 1. Le mode de vie des gammares  2. Le plastique et sa dégradation 3. Le repérage des lieux pour capturer les gammares 4. La logistique autour de notre expérimentation 5. La gestion d'un planning pour réaliser l'expérience 6. Le plan d'expérience/protocole
L'ensemble des informations sera ici ajouté. Il semble aussi important de se fixer la semaine prochaine sur la forme de la cuve et sa fabrication pour essayer rapidement de mesurer le microplastique dans un environnement qui sera proche - voir identique - à celui que nous utiliserons au cours de l'expérimentation. De même, il serait utile de se fixer un délai pour réaliser l'expérience afin d'avancer à la bonne vitesse.
Le plastique et sa dégradation
La première question à laquelle répondre est le choix du plastique à utiliser. Dans l'expérience de l'article dont nous nous inspirons, le plastique utilisé est le polyéthylène car il s'agit de l'un des polymères les plus courants dans les produits de soins personnels et, par conséquent, dans les systèmes aquatiques (par la pollution). De plus il est probable qu'il soit consommé par les gammares car sa densité et inférieure à celle de l'eau, il flotte donc en surface, et les gammares sont capables de  collecter de la nourriture à la surface de l'eau, y comprend des lentilles d'eau flottantes.Nous avons donc décidé d'utiliser aussi ce plastique, quant à la taille des morceaux à introduire dans les cuves il s'agirait d'éléments de 15 à 40 micromètre de diamètre. pour nous en fournir nous comptons soit sur : -Nous en fournissons directement au fablab -Acheter un rouleau sur internet puis le découper nous même grâce à une micro broyeuse -Ou grâce à une ponceuse suivi d'un tri par filtre pour ne sélectionner que les tailles qui nous intéressent
Techniques de mesures de la quantité de plastique à la fin de l'expérience : Nous sommes passés par différentes idées, pour compter/déterminer la quantité de nano ou micro plastique à la fin de l'expérience et ainsi conclure sur la question de la fragmentation du microplastique par nos gammares. Dans tous les cas, nous souhaitons faire des observations au microscope pour avoir un support visuel sur lequel se baser. Il faudra aussi faire des études statistiques. Nous pensons aussi pouvoir colorer les microplastiques afin de faciliter l'observation, notamment si nous faisons une lyse des gammares
-Filtre à nano ou micro particules. On prélève des petits volumes d'eau de la cuve qu'on filtre puis on compte/pese la quantité de fragments trouvés et on compare à ce qui a été introduit initialement. -Evaporation : On prélève v puis on fait s'évaporer l'eau : il reste les micro et nano plastiques et dedans on mesure la masse / compte + obs microscope. Si il ya des fragmentations on observe un plus grand nombre de fragments et ils seront plus petits -Centrifugation : On prélève v et on fait centrifuger : dans le culot il y aura des micro et dans le surnageant de nano -> facilite le comptage

La logistique autour de notre expérimentation
Taille et fonctionnement des cuves : 2L avec bulleur pour oxygéner les cuves (montage en série pour utiliser moins de bulleur) Faire du microplastique : Ultra turax pour "mixer" à haute vitesse le plastique et obtenir des micro particules (mais taille non contrôlable) ou utiliser une ponceuse pour avoir de la "poussière" de plastique qui fera office de micro particules (mais pareil, taille incontrôlable) Transport et stockage des gammares : Transport dans des bouteilles en plastique transparentes industrielles contenant l'eau du milieu de l'organisme et dépôt des gammares le plus vite possible dans les cuves sur le campus Pierre et Marie Curie.Prévoir, en plus, des bouteilles contenant uniquement l'eau du milieu où évolue l'organisme pour ne pas manquer de liquide dans les cuves Nourriture pour gammares : gammares --> détritivores --> nourriture pour poisson/crevettes suffira
Gestion d'un planning pour l'expérimentation / protocole / plan d'expérimentation

Suite à divers échanges et réflexions, nous sommes en train de construire le plan d'expérimentation (qui doit être fini pour le 20 octobre). Il est préférable pour des questions pratiques, et de maximisation de la randomisation, de réaliser notre expérimentation en plusieurs temps successifs tout en conduisant nos différentes conditions en parallèles. Nous avons 3 conditions (4 si nous décidons de tester une condition contrôle en plus : a savoir eau claire + gammare sans introduction de plastique - dans le but de vérifier que les gammares ne rejettent pas naturellement du nano plastique dans l'environnement). La durée d'une condition est de 4 jours (l'intervalle entre les mises en place des 4 jours d'expérimentation est nommé rotation).Nous allons donc réaliser une fraction de chaque condition en parallèle des autres, et de répéter ces fractions tous les 4 jours jusqu'à avoir assez de mesures pour une analyse statistique viable.
Si l'on souhaite réaliser 15 répétitions de chaque conditions, on se retrouve à 15x3 ou 15x4 : soit 45 ou 60 mesures au total. Dans le cas des 3 conditions, nous aurions besoin idéalement de 15 cuves pour gammares. On peut alors faire 5 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 3 rotations soit 12 jours au total. Dans le cas des 4 conditions, nous aurions besoin idéalement de 16 cuves pour gammares. On peut alors faire 4 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 4 rotations soit 16 jours au total.

Sachant qu'il nous faudra randomiser à la fois les emplacements des conditions à chaque rotation et les expérimentateurs venant s'occuper des gammares et des cuves vides.
Globalement, il reste la question des gammares : - Doit-on les chercher à chaque rotation dans la rivière ou bien les stocker en attendant leur mise en cuve ? Il semble que dans les deux cas, cela pose des limites concernant l'interprétation des résultats. La solution la plus pratique est tout de même le stockage. Il faut par ailleurs faire attention à la possible présence d'un parasite du gammare, et qui réduit son ressentiment. - Combien de fois les nourrir avant les 4 jours, combien de fois par jour ? On note ici une information encore jamais explicite dans le document : les gammares, une fois l'expérience acquise (donc durant les 4 jours d'expérimentation) ne sont pas nourries.Le début de l'expérimentation est consécutif à une induction de microplastique de type polyéthylène dans toutes les cuves.

Rapport du 24/11/2022
Après réflexion, on va mesurer :

Mobilité en longueur : on pose chaque lot de 5 individus sur une feuille quadrillé, on filme leurs mouvements et on compte le nombre de fois qu'ils changent de carreaux. On fait qql secondes de vidéos et plusieurs répliques pour chaque vu. On capturera 30 secondes de vidéos pour chaque cuve s'il y a beaucoup de mouvement durant la prise ou alors 1 minute si les gammares ne bougent pas beaucoup.
Nombres de gammares liés : le fait que certains gammares se déplacent à 2 traduit un comportement reproducteur qui pourra nous permettre probablement de faire un lien entre concentration d'hormone et comportement reproducteur.
Nombre de mort par cuves : survie des gammares

Nous ne savons pas encore si nous allons indivisualiser nos observations par rapport à chaque gammare dans la cuve ou alors faire une moyenne des données obtenues de chaque cuve, on penche plus pour une moyenne voiture, statistiquement c'est plus simple à traiter, mais il ya quand même des désaventages. On a commencé à faire les mesures. On a prélevé les gammares dans 6 cuves aléatoirement pour les mettre dans 6 boites ( XxY ) remplies avec 100 mL d'eau de la rivière posées sur des feuilles cadriées (1cm=1carreau). Il y a donc 6 gammares par cuves. On a mis des objets opaques autour des boites pour éviter que les gammares ne soient trop autorisées pendant l'enregistrement par la lumière. On a mis le téléphone à une hauteur de X cm de manière à enregistrer les 6 cuves en même temps.On agit les gammares avec une baguette en bois après qu'on les ait tous mis dans les cuves, on laisse reposer 2 minutes et enfin on enregistre la vidéo pendant 1 minute. On a fait tous les enregistrer aujourd'hui, cela fait donc 3 minutes d'enregistrement en tout pour 24 cuves à observer.

L'effet d'un polluant (Bouillie bordelaise) sur Physarum polycephalum (Blob).

( contacts : Rafael.Huertas@etu.sorbonne-universite.fr ; clement.beouch.1@etu.sorbonne-universite.fr ; Lucie.Mazzola@etu.sorbonne-universite.fr ; mona.grelet@etu.sorbonne-universite .fr )

    Dans le cadre de l'UE LU3SV564 intitulée "Démarche scientifique et application à l'écologie" nous avons comme projet d'étudier le blob, Physarum policephalum, et notamment de voir la réaction et les effets qu'ont les polluant sur lui. Sur cette page vous allez trouver des guides sur la maintenance de cette espèce, ainsi que l'avancée de notre projet qui a beaucoup évolué durant le semestre.

Guide pour commencer un élevage de blob (c'est très simple) :

Matériels :

un sclérote de blob ( la souche MALU marche très bien)

une pipette avec de l’eau

des boîtes de pétri

de l’agar-agar

une balance

une spatule

des flocons d’avoine BIO

Explications : 

    Pour pouvoir commencer votre élevage de blob, il vous faut dans un premier temps préparer le milieu dans lequel vous allez les maintenir. Pour cela il vous faut préparer des boîtes de pétri avec de l’agar à 2%. Essayez de préparer plusieurs boîtes dès le début pour pouvoir anticiper les futures multiplications, le blob se développe très vite. Pour conserver les boîtes de pétris, placez-les dans un frigo.

    Après avoir coulé les boîtes avec votre agar chauffé, laissez-les refroidir mais attention à ne pas perdre l’humidité des boîtes. Une fois que les boîtes ont refroidi, vous pouvez positionner le sclérote sur l’agar. Pour pouvoir réactiver le blob, il faut humidifier le papier sur lequel il est positionné. Attention, il ne faut pas mettre directement l’eau sur le blob, mais bien sur le papier à côté. De plus, seules quelques gouttes suffisent (2-3 suivants la taille du sclérote), il ne faut pas noyer le blob ou inonder la boîte. Après avoir fait cela, refermez la boite et positionnez la à l’obscurité (le blob n’aime pas trop la lumière).

    Pour le nourrissage, je vous conseille de ne pas en mettre le jour où vous les réveillez mais attendez plutôt le lendemain pour vérifier s'ils se sont bien réveillés. En terme de quantité de flocons d’avoine à mettre, la première semaine vous pouvez mettre quelques flocons dans la boîte à l’aide d’une pince, il ne faut pas en mettre beaucoup dès le début, c’est souvent la nourriture qui amène les problèmes (champignons/bactéries). Quand vous voyez que le blob se déplace de plus en plus, vous pouvez au fil des multiplications augmenter la quantité de nourriture.
Guide pour faire un sclérose (c'est simple aussi) :

Après avoir pris la main sur l’élevage de blob, vous allez sans doutes vouloir essayer de créer des sclérotes (état de dormance du blob).

Matériel :

un blob en bonne santé (sans champignons ou bactérie dans sa boite)

papier-filtre (je conseille le filtre à café = 100% de réussite)

une boîte de pétri neuve

une spatule

Explications : 

    Le but des sclérotes est de faire rentrer son blob en dormance pour pouvoir le conserver plus longtemps ou pourquoi pas en donner pour que d'autres personnes commencent un élevage.

    Pour faire cela, vous allez prélever un bout de blob (assez dense si possible) et le positionner sur le papier-filtre humide. Placez le papier-filtre avec le blob dans une nouvelle boîte propre. Vous devez au moment où le blob quitte l’agar, et se retrouve sur le papier-filtre, enlevez l’agar (pour éviter qu’il n’y retourne). Une fois que le blob est sur le papier, il va petit à petit se dessécher avec le papier pour devenir un sclérote.

    Je vous conseille de faire tout au long de votre élevage des sclérotes. En effet, une invasion de champignons peut vite arriver et donc si vous avez des sclérotes de côté vous pouvez reprendre votre élevage sans problème.

    J’espère que vous avez compris mes deux guides, vous pouvez continuer de regarder notre page, il y a des photos en plus, cela pourrait être plus parlant. Si vous avez des questions sur la maintenance des blobs vous pouvez me contacter je me ferais un plaisir de vous aider :) ( Rafael.Huertas@etu.sorbonne-universite.fr )

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Rapport 14/10/2022 :
Aujourd’hui nous sommes allés au GreenLab pour voir si nous pouvions réveiller des souches de Physarum polycephalum afin de pouvoir s'entraîner sur la maintenance de l’espèce.

-> On peut voir ici un sclérote de blob. Une des caractéristiques de cet organisme est qu’il peut entrer en phase de dormance (qui peut durer des mois voir des années si les conditions pour sa survie ne sont pas réunies)

Après avoir récupéré des boîtes de pétri déjà préparées avec de , nous avons réveillé les souches sous une hotte pour pouvoir garder le milieu le plus stérile possible.
Pour pouvoir réveiller les souches, il suffit juste d’humidifier le papier sur lequel est le sclérote. Ainsi, le blob va se réveiller et aller ensuite se balader dans la boîte de pétri à la recherche de nourriture.

Pour pouvoir surveiller le réveil et pouvoir leur donner à manger, nous avons décidé de ramener les souches chez nous pendant le week-end.

Rapport 17/10/2022 :

Pendant le week-end, les souches se sont bien réveillées mais se déplacent très lentement, voire stagnent sur le papier.  Nous avons déposé les blobs au Greenlab pour voir s' ils reprennent une croissance normale.

Rapport 19/10/2022 : 
Nous sommes venus au laboratoire pour voir comment allaient les blobs. Les deux souches ne se développent plus du tout et prennent une couleur blanchâtre synonyme de mort de l’organisme. Plusieurs facteurs pourraient expliquer cela : les températures, les conditions ne sont pas adéquates pour le développement de l’organisme; le transport des blobs pourrait aussi expliquer cet événement (choc thermique); où simplement le fait que les sclérotes n’étaient pas fiables…
On voit sur cette photo que les souches ne se développent plus et sont de couleur blanche.

 On a donc décidé de réveiller trois autres souches de localités différentes présentes dans le stock de sclérotes du laboratoire, 2 blobs “Malu” du CNRS et une souche “Mikado” japonais qui est connue pour être très rapide.

 Après avoir choisi les souches à réveiller, il faut donc préparer le milieu dans lequel nous allons les maintenir. Pour cela, il nous faut de l’agar agar et de l’eau que nous allons monter à ébullition et ensuite verser dans les boîtes de pétri le mélange lorsqu’il est encore chaud.

                                         Gauche : L'Agar Agar, c'est ce qu'on utilise pour préparer nos boite de petri; Droite : Boite de petri après avoir coulé l'agar

 
Je me suis entraîné à faire la préparation pour quelques boîtes de pétri avec pour ratio 1g d’agar pour 100ml d’eau. J' ai ensuite préparé d’autres boîtes avec le mélange que M.Hubert m'avait préparé au préalable.

Préparation de plusieurs boites de pétri sous la hotte

Une fois que l'agar a refroidi, nous pouvons poser les sclérotes dessus et les humidifier afin de réveiller les blobs.
Voici à quoi ressemble la boite de petri lorsqu'on démarre le réveil d'un blob

Nous les avons ensuite enfermés avec du papier aluminium pour pouvoir les garder dans l'obscurité (car les blobs grandissent plus vite dans l'obscurité), en attente de leur réveil afin de les nourrir par la suite. Pour information, pour les nourrir, nous utilisons des flocons d'avoine BIO (les blobs raffolent de l'avoine).

Reportage le 20/10/2022 : 
Changement de problématique (à expliquer)  Nous avons aussi décidé de contacter Madame Dussutour pour lui poser quelques questions afin de savoir par exemple quel répulsif elle utilisait lors de ses expériences sur Physarum polycephalum.

Reportage 21/10/2022 :
Ce vendredi, nous sommes passés pour nourrir les blobs et voir leur développement. Les deux souches "Malu" du CNRS, se sont réveillées très rapidement et sont déjà en recherche de nourriture, j'en ai donc mis dans leur boîte. Quant à la souche japonaise "Mikado", aucun signe de réveil sur la boite, j'ai tout de même mis quelques flocons d'avoine pour peut-être "stimuler" son déplacement/réveil.

Rapport 22-23/10/2022 :

Ce week-end, j'ai fait des tests avec des ponts sur une souche AVA que je possède chez moi depuis quelques semaines pour m'entraîner à la maintenance de l'espèce.

J'ai pris deux échantillons de ma souche mère, une passera sur un pont de 2 cm et une autre sur un pont de 4 cm.
J'ai commencé par créer les ponts à base d'agar (les ponts étant très petits, l'agar était plutôt fragile et se cassait facilement). Pour pouvoir être précis dans la découpe j'ai fait des structures en papier afin de respecter les distances.

On peut voir sur la photo les deux challengers que j'ai choisis pour faire le test ainsi que les feuilles me permettant de faire les ponts. Après avoir tout préparé, je dispose les deux blobs, les ponts et l'avoine (qui symbolisent l'arrivée) sur une boîte de petri sèche afin d'éviter l'évasion des blobs lors du test.

J'ai préparé mon appareil photo sur un trépied et j'ai décidé de prendre des photos toutes les 30 minutes pour voir l'avancée des blobs… départ annoncé à 11h pile (samedi).

On peut voir sur la vidéo des images de 11h à 23h du samedi (toutes les 30 minutes environ) et la toute dernière image est à 8h30 le dimanche.
Plusieurs problèmes/imperfections sont à relever. Tout d'abord, on peut voir dans la vidéo que le blob perd beaucoup trop de temps à descendre de sa plateforme d'origine, les quantités d'agar agar n'étant pas les mêmes (il faudra faire attention à cela lors des vraies expériences que nous prévoyons de faire). Il y a ensuite les facteurs lumière et température qui entrent en jeu, en 12h de déplacement (le samedi), il y avait un peu de lumière dans la pièce et surtout une température de 19 à 20 °C, alors que de 23h à 8h30, la pièce était plongée dans le noir à une température allant de 17°C à 18°C. On voit que le blob s'est déplacé beaucoup plus rapidement la nuit que le jour, il faudra garder les mêmes conditions dans nos futurs tests. ( Il faut savoir que cette souche AVA est censée être au top de sa forme à 24°C)

Nous voulions partir sur des ponts de 4 cm de longueur et 1 cm de largeur mais avec mes tests, je pense qu'il serait plus judicieux de faire des ponts de 2 cm de longueur et 1 cm de largeur. Ce sera plus simple à faire et plus rapide à traverser pour le blob. D'autre part, je pense que le blob du pont à 4 cm était moins développé de base que celui du pont à 2 cm. Il faut donc aussi s'assurer que les blobs sont tous développés au même niveau.
Image du test avec le pont de 2 cm de longueur

Image du test avec le pont de 4 cm de longueur

Image montrant le problème des différentes hauteurs des plateformes d'agar
On ne peut pas vraiment se baser sur mes tests car j'ai commis beaucoup trop d'erreurs. Mais pour le déplacement de 23h à 8h30 :

                  Image du test à 23h le samedi                                                             Image du test à 8h30 le dimanche
On voit que sur une durée de 9h30, le blob a presque traversé l'entièreté du pont de 2 cm. De plus on peut voir en dessous de la boite que le blob était arrivé depuis un bon moment (je pense que le blob a mis moins de 8h pour faire toute la traversée). Le temps que mettrait le blob nous inquiétait pour le bon déroulement de nos tests, mais si on réalisait de bonnes conditions, le blob peut faire en quelques heures le déplacement.

On voit sur cette image que le blob est déjà sur la plateforme depuis un certain temps...
Choses à retenir pour les prochains tests :

maintenir les mêmes conditions tout au long du test
faire attention à la quantité d'agar entre les différentes plateformes
avoir des blobs développés au même niveau.

Rapport mois de Novembre : 
Pendant le mois de novembre, nous avons bien avancé sur nos recherches. Dans un premier temps, nous avons accéléré notre manière de multiplier nos souches de blobs. En effet, nous avons suivi la technique mise en place par Mme Dussutour, il s’agit de doubler presque tous les deux jours la colonie en coupant la moitié de la boîte. Mais avec cette technique vient l'arrivée de plusieurs problèmes comme l’invasion de champignons, bactéries impactant nos blobs…
Voici un florilège de photos des meilleures contaminations que nous avons eu :

Mais malgré tout cela nous avons tout de même réussi à multiplier notre souche :

Préparation de toutes nos boites de pétri avant de multiplier nos blobs

On peut voir ici la méthode mise en place pour multiplier au plus vite nos blobs. Chaque souche est coupée en deux pour être remise dans une autre boite.

Nous nous sommes ensuite intéressés au polluant auquel le blob pourrait être confronté dans son milieu naturel. En effet, en s’inspirant de l’étude de Mme Dussutour, nous nous sommes demandé si le blob pouvait, comme avec le sel, acquérir une résistance à un polluant qu’il pourrait rencontrer et l'empêcher d’accéder à sa nourriture dans la nature.

Nous avons donc cherché différents polluants qu'il pourrait être intéressant de tester sur nos blobs pour voir comment ils réagissent.

Nous avons donc pensé à la bouillie bordelaise, au cuivre, au plastique ou encore au sel de déneigement. Ensuite nous avons lancé des tests sur ces polluants.  ( nous avons pensé à d’autres polluants comme la nicotine, le fer ou encore tout type de carburant mais nous avons fait avec ce qu’on avait a disposition dans le laboratoire et ce qui était le plus simple à utiliser.)
Nous avons donc fait plusieurs préparations d'agar avec les différents polluants. Nous les avons coulées dans des boites carrés pour pouvoir ensuite faire des ponts.

Nous avons ensuite préparé les différents tests : 

On peut voir que pour la BB (bouillie bordelaise), le blob a essayé de traverser mais n'est pas allé jusqu'au bout. Pour le test avec le plastique, on voit que le blob passe facilement, en effet il ne fait qu'éviter le plastique et se déplace normalement sur l'agar donc ce test n'est pas très intéressant. Pour le cuivre et le sel, on voit que le blob n'essaye même pas de toucher le pont, il fuit directement vers l'opposé.

Nous avons ensuite fait un deuxième test pour déterminer quel polluant serait le plus intéressant à observer, nous avons donc retenu la BB.

Pendant la recherche du polluant, nous avons aussi cherché un moyen de pouvoir enregistrer en direct le déplacement du blob. De pouvoir faire des photos toutes les 30 minutes pour pouvoir après faire des timelapses et voir le déplacement des blobs sur les ponts. Nous avons appris l'existence d’un outil que possède le Fablab pouvant nous être utile pour faire cela: la Rasberry. Nous avons aussi cherché une boîte pouvant garder l’humidité pour les tests et en même temps pouvant faire office de support pour la caméra.

Voici notre première installation pour faire nos tests :
 
Pour faire nos premiers tests, nous avons été obligés de faire 4 tests dans une même boîte pour pouvoir voir tous nos tests sur la caméra. Nous devons faire ces tests sur 15 blobs différents quotidiennement sur 5 jours pour observer un apprentissage et une possible amélioration à la recherche de nourriture. 

Fin novembre, nous avons eu nos premiers résultats sur nos tests, on peut les voir sur l'image de droite.                                  Ces tests nous ont permis de voir plusieurs problèmes... Dans un premier temps, la proximité entre les tests est un problème car les participants préfèrent fusionner entre eux plutôt que de traverser le pont. Ensuite, il y a le problème de la lumière, on sait que le blob n'aime pas la lumière mais pour avoir des bonnes photos nous avons dû mettre des lampes pendant toute la durée du test. Les blobs seraient donc stressés par la lumière ce qui les empêcherait de traverser le pont.

On peut voir sur cette photo que les blobs vont directement se fusionner entre eux. On peut tout de même voir que certains blobs essayent ou ont essayé de passer sur les ponts. De plus on a observé que nous nous étions trompé sur les concentrations de BB dans les ponts. Ainsi, nous devons donc faire des nouveaux tests en corrigeant toutes nos erreurs.

Voici le timelapse de nos tests : Timelapse Tests BB (avec une erreur concentration)

Choses à retenir pour les prochains tests :

Chercher un moyen de faire des tests séparément pour obliger les blobs à aller sur le pont
Garder de l'obscurité lors des tests pour limiter les stress qu'ont les blobs.

Rapport début décembre :

Après avoir observé nos premiers résultats, nous avons dû trouver un autre moyen de faire notre expérience tout en conservant un taux de stress minimal pour le blob. Nous avons donc cherché une autre “boîte” pour faire nos tests ainsi qu’un moyen de pouvoir contrôler la luminosité à l’intérieur. Notre première idée était d’utiliser des minuteurs sur nos lampes, mais après en avoir parlé à Steve, nous avons trouvé une machine nous permettant de remplir toutes nos demandes : le Phytotron.

Voici notre nouvelle installation, nous avons donc changé notre boîte en plastique pour un Phytotron. Cette machine nous permet de contrôler la température ainsi que la luminosité dans la boîte. Ainsi nous pouvons allumer les lumières exclusivement lors de la prise de photo et le reste du temps le blob est dans l’obscurité, qu’il préfère pour se développer.  

On voit sur cette photo comment nous avons fait l’installation à l’intérieur. Nous n'avons conservé que deux étages de grilles, une positionné en hauteur pour pouvoir mettre notre caméra, et une plus basse pour pouvoir poser nos tests.

Dans un premier temps, nous avons fait nos témoins, donc nos blobs sur un pont d'agar sans polluants avec cette installation. Voici le timelapse des témoins : Timelapse Témoin

Nous avons ensuite fait des tests avec 21 mg de BB. En effet, avec nos précédents tests avec 1g de BB, nous n'avons pas eu de résultats concluants. (Voir timelapse = Timelapse tests Bouillie Bordelaise 1g) Peut être cela était lié à la concentration de BB qui serait trop élevée, nous avons donc baissé la concentration.

Voici le timelapse de nos test avec 21mg de BB dans les ponts : Timelapse Tests 21mg de Bouillie Bordelaise
Outre nos multiples tests, notre colonie de blob se multiplie très bien depuis qu'on applique la technique de Mme Dussutour. Nous n'avons jamais eu autant de blobs que depuis ces derniers jours.

L'effet des sons sur la croissance d'arabidopsis thaliana .

I - Introduction

Certaines personnes pensent que, tout comme nous humains, les plantes sont capables de ressentir la musique. Pour être plus précis, elles seraient capables de ressentir les ondes et induire une réponse physiologique. C’est l’idée qu’à étudié Joël Sternheimer, un physicien et musicien français en 1987. Avec l’aide de biologistes et de musiciens, il constate qu’à chacun des 20 acides aminés qui composent les protéines, on peut y associer une note de musique. Il initie une nouvelle science, la génodique, qui étudie les effets de certaines mélodies sur les organismes vivants, et introduit le terme de « protéodies ». Une protéodie, combinaison des mots “protéine et mélodie”, correspond à une suite de notes assemblées dans un certain ordre pour correspondre à une protéine. Nous avons donc cherché à savoir si cette théorie est applicable et s’il est effectivement possible de stimuler ou inhiber la croissance d’une plante grâce à la musique.

2 - Protocole et plan d’expérience

Pour notre expérience, nous allons utiliser des plantes Arabidopsis thaliana qui sont un organisme modèle en biologie végétale de par leur petite taille, leur cycle de reproduction relativement court. Nous allons réaliser trois expériences pour tester la capacité des plantes à répondre à la musique. Chaque condition sera composée d’une boîte contenant 9 pots. Les boîtes sont équipées d’un dispositif lumineux qui sera allumé 10h par jour, ainsi que de haut-parleur pour diffuser la musique. La musique sera émise pendant 10 minutes la nuit grâce à un Raspberry Pi qui sera programmé pour la lancer à une heure précise.
1- Un contrôle avec des plantes qui ne sont exposées à aucune mélodie
2- Une expérience avec des plantes exposées à une mélodie qui stimule la production d’auxine

3- Une expérience avec des plantes exposées à une mélodie qui inhibe la production d’auxine

Pour chaque condition, nous avons fait les tests en double. Nous avions donc 6 boites au total.

3 - Journal de bord
06/10/22
Nous avons élaboré le plan et commencé à discuter des conditions que nous allions appliquer. Nous avons pensé à diffuser des bruits urbains en comparaison à d’autres naturels, mais avons changé d’idée par faute de temps et de complexité, en effet, nous nous retrouvions avec trop de conditions test.
13/10/22

 Nous avons pris rdv avec Michel Duhamel, le président d’une entreprise « Genodics » qui travaille en collaboration avec Joël Sternheimer, et qui cherche à apporter des solutions innovantes aux agriculteurs et éleveurs pour favoriser la croissance de leurs productions et lutter contre les maladies en renforçant le métabolisme des plantes et des animaux et en leur permettant de s’adapter aux variations climatiques.

Lors de notre entretien, Mr Duhamel nous a donné des conseils et mis en grade sur certains points, notamment le fait qu’il faille bien isoler nos conditions les unes des autres pour que les plantes ne perçoivent que la mélodie souhaitée, de plus nous ne connaissons pas les effets sur l’organisme humain donc il est préférable de ne pas trop s’exposer aux mélodies, et si l’on ressent une sensation désagréable en l’écoutant de la stopper immédiatement. Il nous à précisé que son équipe à mené des recherches sur A.thaliana en utilisant les mêmes mélodies.
Pour des raisons de droit d’auteur, il nous est impossible de communiquer les fichiers  audio des mélodies.
24/10/22

Nous avons planté nos graines d’A.thaliana dans nos différents pots et les avons mises à germer dans une cellule de culture à 25°C. Deux membres de l’équipe étaient chargés d’arroser les graines tous les 3 jours jusqu'à la germination.
27/10/22
Nous avons commencé à programmer des raspberry pi pour diffuser le son. Nous avions besoin d’un programme qui lance la musique à une certaine heure pendant une durée précise avant de l’arrêter. Nous avons donc crée ce programme et avons testé s’il fonctionnait avec le type de haut parleur qui étaient à notre disposition.

CODE

import datetime as dt
from time import sleep
from pygame import mixer

start_time = dt.datetime(year=2022, month=11, day=3, hour=10, minute=18, second=0)
duration = dt.time(hour=0, minute=0, second=40)
periodically = dt.time(hour=0, minute=1, second=0)

today = dt.datetime.today()

if today >= start_time:

print("Date déjà passé")

exit()

# Calcul du temps à attendre
inter = start_time - today
print("Secondes : ", inter.total_seconds())

duration = duration.hour * 3600 + duration.minute * 60 + duration.second
periodically = periodically.hour * 3600 + periodically.minute * 60 + periodically.second

print("duration : ", duration)
print("Period : ", periodically)

mixer.init()
mixer.music.load('sample.mp3')

# Attente
sleep(inter.total_seconds())

while True:

print("Play")

mixer.music.play(-1)

sleep(duration)

mixer.music.stop()

print("End")

sleep(periodically)

17/11/22

Nous avons monté nos boîtes. Nous avons installé des lumières LED de 12V et fixé un haut parleur à chaque boîte.
Nous avons rencontré un problème, puisque 1 plante sur 9 seulement a germé.

24/11/22
Étant donné que seulement une partie de nos graines avaient germé et que cela n’était pas suffisant pour l’exploitation des résultats, nous avons décidé de changer d’organisme et avons donc opté pour des pois.

Nous avons planté nos pois dans des boîtes avec du terreau en conservant le même nombre de réplicats avec une moyenne de deux graines par pot.
01/12/22
Une fois les boîtes prêtes et le programme fonctionnel, nous avons lancé notre expérience. Chaque condition était isolée des autres dans une pièce séparée. La lumière était active de 7h00 à 17h30 pour mimer la lumière naturelle en période hivernale. La musique jouait pendant 10 min à 23h.
L’influence de l’environnement sonore sur le chant des grillons


Stievenard Nicola, Venuanzola Luca, Clouard Andrea et Nina SACCO
UE 564- Démarche écologique et scientifique

Objectif de l'UE :

Introduction au thème:

            L’environnement est un facteur déterminant de la vie et des organismes et donc les variations de celui-ci peuvent avoir un impact sur leur mode de vie. En effet, avec l’urbanisation des milieux ruraux on a un bouleversement des écosystèmes avec l'arrivée de nombreuses pollutions tel que la pollution de l’air, visuelle ou sonore. Nous nous sommes intéressés à l'effet d'éventuelles pollutions sonore sur le chant du grillon.

Pour faire une expérience simple, nous avons choisi de tester l'effet des variation d'intensité sonore d'un son fixe, de 5khz (Son qu'émettent et perçoivent les grillons).

On sait que le chant du grillon est un caractère dysmorphique spécifique aux mâles adultes. Le signal émis est court et répété dans le temps avec une fréquence et une périodicité propre à l’espèce, il est perçu par une oreille tympanique sur le tibia des congénères. Le grillon chante autour des 5 khz.

L’intensité du bruit environnant se mesurant en moyenne autour des 60 dB pour les villes contre 30 dB pour un milieu rural, on pourrait s’attendre à ce que les pollutions sonores urbaines modifient la perception du chant et génèrent une modification, entre autres, de ce comportement de signalisation en groupe.
Une étude sur l’effet des camions routiers sur les grillons de différentes espèces met en évidence la corrélation entre le passage de camion près d’une zone et l’interruption du chant des grillons habitant cette même zone. Ils ont aussi montré que certaines espèces chantaient à des fréquences maximales plus élevées que les grillons des zones plus éloignées, avec des intensités de chants différents. Ils présentent donc des adaptations pour mieux être perçus par le groupe. D'autres études sont intéressantes et ont permis de montrer d'autres adaptation.

Journal de bord :
Initialement nous avions fixé un protocole simple: Dans une boîte à vis, chaque compartiment numéroté correspondrait à un groupe ( 1 mâle + 2 femelles pour encourager un éventuel comportement reproducteur) et serait tapissé de mousse isolante. On pourrait administrer des ordres de passages aléatoires à chaque grillons, et en imaginant que les compartiment à vis assuraient une bonne maniabilité des grillons.
On laisserait nos grillons une semaine sous lampe chauffante, puis sur quelques séances ferions nos mesures.

mais nous avons du faire preuve de flexibilité, comme en témoignera notre journal de bord.
17/11/2022:

           Durant cette séance nous avons reçu les grillons et le matériel nécessaire pour l'expérience . On a donc procédé a la mise en boite des grillons par groupe de 3 avec deux femelles et un mâle dans une boîte que l'on range dans un organisateur (type rangement de vis). Mise en boîte pas facile, on faisait tomber un grillons dans la boîte de manipulation (une des boites du rangement, la n°30) : si c'est un mâle (pas d'ovipositeur) on le pèse (pour identifier des variations de chant inter individuelles? ) et on le dépose dans une boîte avec un numéro, qui sera son numéro si c'est une femelle on la dépose avec un mâle.A la fin de ce rangement on a 30 boîtes de trois grillons. Problème 1: Pas de mousse isolante --> on fait sans, en espérant que les enregistrements des grillons ne se chevauchent pas (ça n'a pas été le cas ) On a mis du parafilm et du scotch à l'avant et à l'arrière des boites pour éviter que les grillons s'enfuient, de plus on a laisser l'organisateur a température ambiante dans un coin du Fablab.

Problème 2: pas de douilles pour fixer les lampes chauffantes, on décide de voir le lendemain.

18/11/2022:

         Quelques grillons sont morts ou en fuite dans les boites des autres: on recommence: sauf pour les groupes ou le mâle, vivant, est resté dans sa boîte.

On a donc changé de stratégies d'aménagement des boites de grillons. les grillons ont donc été disposé dans ces même boites mais en dehors de l'organisateur avec une pochette plastique scotchée a la boîte et percée petits trous afin de les laisser respirer. Rajout de gelée (nutrition + hydratation) qu'on avait oublié la veille.Toute les boites ont été stocké dans un incubateur, avec activation de l'aération et à température contrôlée de 24°C.

24/11/2022:

           On a eu une grosse mortalité des grillons, seulement quelques survivants ont été compté.De grosse trace d'humidité dans les boîtes a été observé, de plus nous avons compté plus de grillons femelle survivante que de grillons mâle, de plus sur les grillons mort des tapis de moisissure était présent. On suppose que les causes de la mort des grillons est dû a une humidité trop importante amenant a une asphyxie des grillons ou également dû au manque de nutriment. On a donc procédé au nettoyage des boites, pour supprimer d'éventuelles odeurs de mort (qui étaient bien perceptible pour nous aussi). On s'est rendu compte que les femelles avaient plus survécu, et il semble qu'elles aient eu recours au cannibalisme. Et quelques recherches sur le grillon plus tard, il semblerait que ce soit une espèce ayant facilement recours au cannibalisme en conditions  de promiscuité et de famine.

On a décidé de mettre nos expériences en pause, nous attendrons de pouvoir enchaîner 2  jours consécutifs de mesures.

12/12/2022:

         

On a donc repris l'expérience en changeant certaines choses. On a donc repris les même boîtes en mettant toujours un mâle et deux femelles, le mâle est pesée à l'aide d'une balance de précision avant de les mettre dans une boîte numéroté. On a mis une pochette plastique au dessus des boîtes comme avant mais cette fois-ci on a fait des trous un peu plus gros pour faciliter le passage de l'air, on a également mis un morceau de carotte avec une gelée pour favoriser leurs survie (qui limite les perte d'eau donc les problèmes d'humidité). Après la mise en boîte de chaque grillon on a établie 6 groupes de 5 boîtes ( étant donnée qu'on avait 30 boîtes) à l'aide du logiciel tirokdo qui nous a permis  un tirage aléatoire des boîtes pour former les groupes. Maintenant que les groupes sont formée on a noté qu'elles boîtes était dans qu'elles groupes et on les a tous mis dans l'incubateur bien aéré et à température contrôlée de 22°C.

Problème: nous avions mal compris les notions acoustiques de dB, nous voulions soumettre nos grillons à des valeurs connus exprimées en dB SPL (Valeurs de pression acoustique, dans lesquelles sont exprimées  les pollutions sonore humaine ex: 90dB seuil de dangerosité, ect). Nous pensions pouvoir imposer cette valeur choisie (40 dB son rural, 70 dB son de villes/métro et son ambiant), mais cela n'était pas possible donc nous avons imposé contrôle= rien, niveau 1 = le son à 50 % du volume de l'enceinte, niveau 2= le son à 100% du volume de l'enceinte. Les six groupes ont un ordre de passage différent: , controle, niveau 1, niveau 2 ou controle, niveau 2, niveau 1.... ( Pour s'assurer que l'ordre de passage n'ait pas d'influence.

Protocole pour l’enregistrement des chants de grillons:  dans une pièce calme et on a procédé groupe par groupe en laissant trois minutes de calme puis deux minutes d’exposition au son si on expose un son, et ensuite 2 minutes d’enregistrement à l’aide de 5 micros d’enregistrement ( une sur chaque boîte). Le bruit était trop fort, il était préférable de sortir de la pièce et d'activer l'enceinte Bluetooth à distance.

Remarque:
Les grillons sembles apprécier le morceau de carotte ajouté.

13/12/2022:

         

Pas de trace d'humidité sur les boîtes, peu de mortalité ( un seul mâle mort) et peu de fuite ( une seule femelle s'est enfuie): bonne stratégie de mise en boîte. On a échangé le mâle mort avec un nouveau mâle pesé. On est passé a l'enregistrement des chants des grillons, pour cela on a utilisé des micro d'enregistrement et on a cherché une pièce calme ou l'on avait très peu de bruit on a choisit la réserve du fablab. Pour faciliter le chant des grillons on a ajouté un ventilateur chauffage car la pièce avait une température trop basse et les grillons chantait très peu dans le froid. On a procédé groupe par groupe en commençant par le groupe A. On a pu noter que certain groupe chantait très bien (ceux du matin et ceux de fin d'aprèm) et d'autre un peu moins bien (milieu d'aprem).
remarque:
On suppose que les facteurs qui on influencé certain groupes a ne pas chanté en milieu d'après midi était le bruit ambiant qui était plus dérangeant l'après midi dû au nombre de personne au fablab qui était plus important l'après midi.

15/12/2022:

            Maintenant que la partie pratique à été réalisé, on passe a la partie théorie. Pour cela on a utilisé le logiciel Audacity pour analyser les enregistrement obtenus. On a réussi a identifier les chants ce qui nous a permis de les isoler afin de pouvoir les étudier grillons 6.png. Pour étudier les son on a réglé audacity  en décibel et en demi-onde et ont a reporté les intensité obtenus sur un tableau, on à également noté les type de chant. Après avoir obtenus toute les données, on a utilisé le logiciel R afin d'établir des graphiques statistiques afin de pouvoir répondre a notre problématique.
Méthodes et matériels:

      Pour cette expérience nous avons utilisé 90 grillons Gryllus bimaculatus dont 30 mâles et 60 femelles. Pour les isoler on a utilisé des boîtes de rangement en plastique numéroté où l'on a mis des pochettes plastiques tenues par des élastiques, ces pochettes ont été percées au préalable pour éviter l'asphyxie des grillons. Après la préparation des boîtes, on a séparé les grillons en faisant en sorte d'avoir 1 mâle et 2 femelles par boîtes  grillon 1.png. Avant de mettre les mâles ont les a pesée avec une balance.
Pour favoriser leur survie dans ces boîtes nous avons mis pour chaque boîte une gelée et une tranche de carotte avant de d'introduire chaque mâle dans une boîte grillons 2.png.
Après avoir introduit les grillons dans chaque boîte nous avons établie six groupes ayant des ordre de passage différent selon l'exposition au son. Pour établir ces groupes on a utilisé le logiciel tirokdo qui nous a permis un tirage aléatoire des boîtes pour former les groupes grillons 3.png. On a donc 5 boîtes par groupe.
Pour l'enregistrement des chants de grillons on s'est installé dans une pièce calme et on a procédé groupe par groupe en laissant trois minutes de calme puis deux minutes d'exposition au son si on expose un son et ensuite 2 minutes d'enregistrement à l'aide de 5 micro d'enregistrement grillons 4.jpeg. Pour l'exposition au son on a utilisé une enceinte UE BOOM 3.
RAPPORT FINAL: 

L’influence de l’intensité du son ambiant sur l’intensité du chant des grillons n’a pas pu être démontrée.

auteurs: Nicola Stievenard, Venanzuola Lucas, Clouard Andréa, Sacco Nina

Introduction

L’environnement d’un milieu est un facteur déterminant des comportements des organismes qui le composent. L’urbanisation d’un milieu peut bouleverser l’équilibre d’un écosystème qui demandera alors à certains organismes un effort d’acclimatation.

 Le chant du grillon, Gryllus bimaculatus est un trait d’histoire de vie assurant le succès reproducteur des mâles. Le son émis par stridulation, (frottement des ailes antérieures), est d’une fréquence d’environ 5kHz1, il est perçu par une oreille tympanique sur le tibia des congénères situé sur ses pattes avant2.  A savoir que l’intensité sonore à laquelle les grillons réagissent est de 80dB SPL3. Le chant du grillon est un caractère dysmorphique spécifique aux mâles adultes. Le signal émis est court et répété dans le temps avec une fréquence et une périodicité propre à l’espèce.

 Certaines études de corrélation ont mis en évidence un lien entre pollution sonore, élévation de l’intensité sonore, et modification du comportement de chant dans des milieux ruraux comme : l’interruption du chant de grillons 2, la modification des fréquences, des intensités de chant 4 ou encore la désynchronisation entre les congénères 5, très bien illustrés dans le cadre d’études sur le passage de camions à proximité des habitats des grillons étudiés.

Par exposition de mâles à un son continu de 5kHz à différentes conditions d’intensité, nous avons mesuré l’intensité du chant enregistré, avec pour objectif de  montrer une éventuelle différence de l’intensité sonore sur l’intensité du chant émis par le grillon 4.

L’intensité sonore d’un son de 5khz influe-t-elle donc sur l’intensité maximale du chant des grillons ?

L'intérêt de cette question est d’évaluer la capacité de plasticité des grillons à un phénomène relevant de l'anthropisation des territoires.

Nos hypothèses étaient les suivantes:

L’intensité maximale du chant reste inchangée en modifiant l’intensité de l’environnement sonore

L’intensité maximale du chant varie avec l’augmentation du volume sonore.

On suppose que l’environnement sonore aura une influence sur le chant des grillons. On s’attend donc à avoir une différence significative du chant des grillons selon l’intensité sonore.

Matériel et méthodes :

Matériel et méthodes

Captivité des grillons: Boîtes à vis recouvertes de feuilles plastiques percée par nos soins et fermées par élastiques, incubateur à 23°C et gelée de nutrition + carottes.

1 mâle + 2 femelles/ boîte pour encourager comportement reproducteur. (FIG.S2)

Enregistrement  et exposition: Clé USB “espion” dictaphone (x5), Enceinte: Ultimate ears boom 3 , Son utilisé: 5000hz test tone 10hr sur youtube, Chauffage : petit chauffage d’appoint

Logiciels: exploitation des résultats : Audacity , analyse des résultats : R Studio, attribution des groupe de passage: Tirodoko

Nos expériences se sont portées sur Gryllus bimaculatus réputé pour se reproduire a partir de 20°C (Toptimale=30°C), et facile à se procurer.
Nous avons fait le choix d’utiliser un total de 90 grillons d'élevage pour former des groupes de 2 femelles avec un mâle. Chaque groupe à été exposé à toutes les conditions: Bruit ambiant, 50% de la puissance de l’enceinte, 100% de la puissance de l’enceinte.

Pour minimiser les biais, nous avons réparti nos grillons et leur avons attribué des ordres de passage par condition de manière randomisée.
Pour l’enregistrement, nous avons emmené, par groupe de passage (5 boîtes/groupes) les grillons dans une pièce, la plus silencieuse possible, laissant sur des chaises les grillons, les séparant toujours de la même distance et à la même distance de l’enceinte. On déposait les clé USB, prête à l’enregistrement sur chacune des boîtes, puis quittons la pièce.

Pendant l’enregistrement: 2 min d’acclimatation à l’environnement, 3 minutes d’exposition à la condition, et 2 minutes post-exposition (que l’on va exploiter).

Sur audacity: visualisation des données en forme de demie onde, avec choix d’une échelle en DB, on relève l’intensité maximale d’exposition et celle de chant. (FIG.S1)

Analyses des données

Notre variable explicative est l’intensité sonore d’exposition, il s’agit d’une variable ordinale fixée sur 3 niveaux : contrôle, 1 et 2.

Notre variable dépendante est l’intensité du chant des grillons, une variable quantitative continue.

Nos mesures consistaient en une répétition de mesures sur des mêmes sujets pour comparer les moyennes des 3 groupes (contrôles, niveau 1 et niveau 2).

Les données ne suivant pas toutes une loi normale, il fallait exclure l’anova paramétrique à un facteur et nous avons effectué le test non paramétrique Kruskal Wallis.
Résultats: 
Nous avons d’abord procédé à un contrôle, pour s’assurer que les conditions étaient bien différentes en termes d'intensité, car mal fixées (cf discussion), et cela semble être le cas  sur le graphe. (FIG1). Les résultats statistiques indique une valeur de niveau différente du contrôle, mais mises deux à deux les résultats semblent indiquer un égalité ce qui paraît incohérent.

Nous noterons que seuls 60 enregistrements présentaient un bruit exploitable émis par les grillons,répartis en proportions variables , à l’oreille en différents  types de chants (FIG3.A ,B, C): le chant “vrai”, le cliquetis, mixte et autre.

Nous n’avons pas pu mettre en évidence une différence significative entre différentes intensités de chants enregistrés, nous remarquons également qu’elles appartiennent à de larges gammes de valeurs. ( En annexe, nous avons effectué des test supplémentaires sur d’autres paramètres).
Discussion:

L’objectif de notre expérience était de montrer l’influence de l’intensité sonore sur l’intensité sonore du chant des grillons. Les résultats de nos expériences tendent à prouver qu’il n’y en a pas. Pour autant, d’autres études corrélatives de la littérature scientifique semblaient montrer l’existence d’une telle influence de la  part de l’environnement sonore, comme par exemple l’effet du passage de camions à proximité de grillons sur la fréquence de chant et la 4, ou Pour comprendre nos résultats, deux chemins s’offrent à nous: soit l’intensité n’est pas le paramètre de l’environnement qui génère ce changement de comportement de chant des grillons illustré dans ces études corrélatives, soit notre expérience n’a pas pu le montrer.

Et en effet, notre démarche présente de nombreuses voies d’amélioration.

Dans un premier temps, la fixation des conditions n’était pas bien établie, les paramètres de températures dans la salle variaient (Rajout du chauffage, variation dans la journée, bruits parasites,...) influençant peut être le comportement des grillons et la prise de nos mesures. On avait souligné dans les résultats que nos valeurs statistiques ,comparant les intensités d’exposition entre elles, n’indiquent pas de différence une à une. Cela peut être, soit la conséquence d’un manque de maîtrise de R le résultat de ce biais, soit de ce manque de rigueur.

Les conditions de captivité des grillons n’étaient pas optimales ( Peu d’espace, humidité, température), le sachant nous nous sommes pressés pour faire nos expériences en espérant que nos grillons ne meurent pas. (Nous avions eu des problèmes de cannibalisme et mort de quasiment tous nos grillons sur une semaine lors de notre première tentative).

Cela pose des questions sur la répétabilité de l'expérience, et pose un éventuel biais pour le comportement des grillons.

Si l’on s'intéresse à l’exploitation des résultats, nous avons choisi d’exploiter l’ensemble des chants que nous avons pu enregistrer, premièrement car nous n’avions pas assez de connaissances sur le chant des grillons pour envisager d’exclure les cliquetis et autres, mais également parce nous n’avions pas assez de vrai chants pour faire de vraies statistiques. Dans le cas ou les cliquetis et autres ne sont pas de vrais chants, au sens de la communication (Il pourrait s’agir par exemple d’une réaction de stress, par frottement des ailes par exemple), inclure ces derniers fausserait entièrement nos résultats,d’autant que la proportion de vrai chant est très différentes entre les conditions (FIG.S3).

D’autre part, nous avions mal compris la notion d’intensité sonore et de décibel, nous souhaitions initialement exposer nos grillons à différents dbSPL de pression acoustique, perçus par l’oreille humaine (Ceux dont on parle au quotidien, seuil d’audition, etc), mais ce sont des décibels différents que ceux mesurés dans des enregistrement qui sont des dB FS6. C’est pendant l’analyse des résultats, en voyant des décibels de valeurs négatives que nous avons réalisé, trop tard, notre erreur.

Cette erreur fait perdre son sens à l'intérêt de notre expérience, qu’on a voulu inscrire dans le cadre des pollutions sonores ,souvent exprimées en dBSPL, car on ne sait pas ce que représentent ces mesures concrètement. CF bibliographie annexe.

Il nous faudrait donc revoir notre protocole : faire des enregistrements sur un plus grand nombre de grillons, privilégier des lampes chauffantes à l’incubateur, trouver une pièce isolée, calme adaptée à des enregistrements.

Conclusion:
Pour conclure, nous n'avons pas pu rejeter l’hypothèse selon laquelle l’intensité sonore environnementale est sans influence sur l’intensité du chant des grillons.

Notre expérience était soumise à de nombreux biais, et sa valeur scientifique est discutable, les résultats que nous avons donc obtenus ne permettent pas de conclure sur l’absence de causalité entre les intensités d’exposition et de chant, mais elle n’est pas suffisante pour démontrer qu’il en existe un. 

Bibliographie:
1 Jonsson, Thorin, Fernando Montealegre-Z, Carl D. Soulsbury, et Daniel Robert. « Tenors Not Sopranos: Bio-Mechanical Constraints on Calling Song Frequencies in the Mediterranean Field-Cricket ». Frontiers in Ecology and Evolution 9 (2021). https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2021.647786.2 Schöneich S. Neuroethology of acoustic communication in field crickets - from signal generation to song recognition in an insect brain. Prog Neurobiol. 2020 Nov;194:101882. doi: 10.1016/j.pneurobio.2020.101882. Epub 2020 Jul 13. PMID: 32673695.3 Jones, M. D. R., et M. Dambach. « Response to Sound in Crickets without Tympanal Organs (Gryllus Campestris L.) ». Journal of Comparative Physiology 87, no 1 (1973): 89‑98. https://doi.org/10.1007/BF00699298.4 Duarte, Marina H. L., Ernesto P. Caliari, Marina D. A. Scarpelli, Gabriel O. Lobregat, Robert J. Young, et Renata S. Sousa-Lima. « Effects of mining truck traffic on cricket calling activity ». The Journal of the Acoustical Society of America 146, no 1 (juillet 2019): 656‑64. https://doi.org/10.1121/1.5119125.5 M. Hartbauer, M. E. Siegert, I. Fertschai, et H. Ro¨mer. « Acoustic signal perception in a noisy habitat: lessons from synchronising insects », s. d. https://link-springer-com.accesdistant.sorbonne-universite.fr/content/pdf/10.1007/s00359-012-0718-1.pdf.6 Eschalier N., Les différents types de décibels (dB), consulté le 21/12/2022: https://deveniringeson.com/decibels-db/

Liens annexes pour comprendre audacity / Les décibels:

Des decibels négatifs sous audacity ?, Forum Audiofanzine, consulté le 21/12/2022: https://fr.audiofanzine.com/forums-thematiques/forums/t.531686,des-decibels-negatifs-sous-audacity.html
Spectrogram View, Audacity Manual, consulté le 20/12/2022: https://manual.audacityteam.org/man/spectrogram_view.html#meaning