Microbiologie

Technique de l'état frais

1- But:

Étude microscopique des bactéries vivantes pour évaluer la mobilité, la densité, la morphologie et le mode de groupement.

2- Principe:

Observation de colonie bactérienne étalée sur lame par un microscope optique. 

3- Matériel:

4- Étapes:

ATTENTION: manipulation en milieu stérile

Forme
 Mobilité
 Groupement 
 Densité
Bacilles ou coque
 - ou + vraisemblablement péritriche ou polaire selon le cas et préciser la vitalité
 paire ou isolé ou chainettes ou amas
 évaluation de la proportion de chaque germe dans un mélange 

Milieux de sélection

Introduction

Les milieux de culture de bactérie font souvent l'objet d'étude en microbiologie. Il est possible de travailler sur des milieux sélectifs permettant de sélectionner un ou plusieurs types de microorganismes selon différents facteurs. On dit d'un milieu qu'il est sélectif lorsque les besoins nutritifs et les conditions de développement propres à une espèce microbienne sont respectés pour que celle-ci vive. 

Ainsi, il existe de nombreux milieux où ces conditions (pH, température d'incubation, source nutritive...) diffèrent afin d'avoir un panel de milieux de sélection intéressant. 

Quelques types de milieux sélectifs gélosés

Gélose MacConkey 

Ce milieu permet de sélectionner des bacilles Gram-négatif, qui deviennent rose si elles fermentent le lactose. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,2 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Gélose Sabouraud

Ce milieu permet de sélectionner des fungi et particulièrement des levures, des dermatophytes et autres champignons pathogènes ou non. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 5,6 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Gélose XLD

Ce milieu permet de sélectionner les agents pathogènes entériques Gram-négatifs et particulièrement les salmonelles et les shigelles. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,4 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Gélose Drigalski

Ce milieu permet de sélectionner des bacilles à Gram-négatif non exigeants. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,4 +/- 0,2 et une température d'incubation à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Gélose TCBS

Ce milieu permet de sélectionner de Vibrio. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 8,6 +/- 0,2 et une température d'incubation à 50°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Lorsque les colonies deviennent jaunes, le milieu s'est acidifié par fermentation du saccharose (saccharose+), à l'inverse, sans fermentation, elles deviennent vertes ou bleues (saccharose-).

Gélose de Chapman ou gélose au sel de mannitol

Ce milieu permet de sélectionner des staphylococcus. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,5 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

Le milieu devient jaune, quand il s'acidifie signifiant que les bactéries ont fermenté le mannitol (mannitol+). En l'absence de fermentation, le milieu reste rouge (mannitol-).

Gélose au sang

Ce milieu permet de sélectionner de toutes les bactéries non exigeantes, les corynébactéries et quelques bactéries exigeantes. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,3 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

En cas d'hémolyse complète, le milieu est totalement transparent mais est légèrement trouble quand l'hémolyse est partielle. Le milieu reprend sa couleur initiale (jaune clair), quand la digestion de l'hémoglobine est complète, mais devient verdâtre quand elle est incomplète.

Milieu Mueller-Hinton

Ce milieu permet de sélectionner des antibiotiques. Les conditions de culture de ce milieu sont un pH à 7,4 +/- 0,2 et une température à 25°C. La composition du milieu pour 1L est la suivante:

 

Les milieux sélectifs liquides

[à documenter]

Coloration de Gram

Méthode de Coloration de Gram

La coloration de Gram est une technique de coloration utilisée en microbiologie pour différencier les bactéries en deux groupes principaux, appelés Gram-positives et Gram-négatives. Le principe de cette coloration repose sur les différences dans la composition de la paroi cellulaire des bactéries.

Le critère principal qui détermine la différence entre les deux types de bactéries est l'épaisseur de leur paroi cellulaire. Les bactéries Gram-positives ont une paroi cellulaire épaisse composée principalement de peptidoglycane, tandis que les bactéries Gram-négatives ont une paroi cellulaire plus mince composée de peptidoglycane et d'une membrane externe contenant du lipopolysaccharide.

Objectif :

Différencier les bactéries en fonction de la composition de leur paroi cellulaire.

Matériel nécessaire :

  1. Échantillon bactérien
  2. Cristal violet (solution violet de gentiane)
  3. Lugol (solution d'iode)
  4. Éthanol ou alcool éthylique
  5. Fuchsine

Procédure :

  1. Fixation : Fixer les bactéries sur une lame de verre en les chauffant légèrement. Cela peut être fait en passant la lame au-dessus d'une flamme.

  2. Coloration initiale : Appliquer le cristal violet sur les bactéries. Laisser agir pendant environ 1 minute.

  3. Fixation du cristal violet : Ajouter le Lugol (solution d'iode) sur le cristal violet. Laisser agir pendant environ 1 minute. Cette étape fixe le cristal violet dans la paroi cellulaire.

  4. Décoloration : Laver la lame à l'éthanol ou à l'alcool éthylique. Cela élimine le cristal violet des bactéries. La durée de décoloration doit être surveillée attentivement, car elle varie selon les types de bactéries.

  5. Contre-coloration : Appliquer la fuchsine sur les bactéries. Laisser agir pendant 1 minutes. La fuchsine colore les bactéries qui ont perdu le cristal violet.

  6. Lavage final : Rincer la lame à l'eau pour éliminer l'excès de colorant.

  7. Observation : Observer les bactéries au microscope. Les bactéries qui conservent la coloration violette sont appelées "Gram-positives", tandis que celles qui prennent la coloration safranine sont appelées "Gram-négatives".

Résultats :

Galerie API

Fiche Technique : Les Galeries API en Microbiologie

 

Introduction aux Galeries API en Microbiologie

Les galeries API (Analytical Profile Index) sont des systèmes standardisés utilisés en microbiologie pour l'identification rapide et fiable des microorganismes, y compris les bactéries et les levures. Ces galeries se composent de bandelettes avec plusieurs tests biochimiques, chaque test permettant de détecter une réaction spécifique du microorganisme à un substrat donné.

Principe de Fonctionnement

Types de Galeries API en Microbiologie

Galeries API pour Bactéries

  1. API 20E
    • Utilisé pour l'identification des bactéries entérobactéries.
    • Comporte 20 microtubes pour la détection de réactions biochimiques spécifiques.
    • Temps d'incubation : 18 à 24 heures.
  2. API Staph
    • Conçu pour identifier les espèces du genre Staphylococcus.
    • Teste des réactions enzymatiques et métaboliques.
    • Temps d'incubation : 18 à 24 heures.
  3. API 20NE
    • Utilisé pour l'identification des bactéries non-fermentaires.
    • Inclut des tests pour la détection de diverses activités enzymatiques.
    • Temps d'incubation : 24 à 48 heures.

       

Galeries API pour Levures et Champignons

      1. API 20C AUX
        • Conçu pour l'identification des levures.
        • Comporte des tests pour l'assimilation des glucides.
        • Temps d'incubation : 48 à 72 heures.
      2. API Candida
        • Spécifique pour l'identification des différentes espèces de Candida.
        • Basé sur des tests d'assimilation de sucres.
        • Temps d'incubation : 24 à 48 heures.

Comparaison des Principales Galeries API

Galerie API

Type de Microorganismes

Nombre de Tests

Temps d'Incubation

Principe d'Identification

Exemples d'Usage

API 20E

Bactéries entérobactéries

20

18 à 24 heures

Tests biochimiques multiples

Identification de E. coli, Salmonella

API Staph

Staphylococcus spp.

20

18 à 24 heures

Réactions enzymatiques

Identification de S. aureus

API 20NE

Bactéries non-fermentaires

20

24 à 48 heures

Activités enzymatiques

Identification de Pseudomonas aeruginosa

API 20C AUX

Levures

20
 

 

48 à 72 heures

 

Assimilation des glucides

Identification de Candida albicans

API Candida

Candida spp

10

24 à 48 heures

Assimilation des sucres

Identification de Candida glabrata

Exemple de Procédure avec API 20E

  1. Préparation de l'Inoculum

Schéma d’une Galerie API

image.png

Applications et Limites des Galeries API

Applications

Limites

Autres Galeries API

Bacilles Gram (-)

API® 20E

Identification des bacilles Gram (-) en 18-24 heures

Rapid 20E

Identification rapide des Entérobactéries en 4 heures

API® 20 NE

Identification des bacilles Gram (-) Non-Entérobactéries en 24-48 heures

API® 10 S

Identification simplifiée des bacilles Gram (-) en 18-24 heures

Levures

API® Candida

Identification des levures rencontrées dans les infections cliniques en 18-24 heures

API® 20 C AUX

Identification des levures en 24-48 heures

Staphylocoques

API® Staph

Identification des Streptocoques et apparentés en 4 ou 24 heures

Streptocoques

API® 20 Strep

Identification des Streptocoques et apparentés en 4 ou 24 heures

Bactéries Anaérobies

API® 20 A

Identification des bactéries anaérobies en 24-48 heures

Autres bactérie

API® Coryne

Identification Corynebactéries et Corynéformes en 24 heures

API® Listeria

Identification Listeria en 24 heures

API® NH

Identification des Neisseria, Haemophilus and B. catarrhalis en 18 à 24 heures

API® Campy

Identification des Campylobacter en 24 heures

API® 50 CH

Galeries “Recherche’’ (métabolisme des hydrates de Carbone)

 

 

 

 

Sources Bibliographiques

  1. Murray, P. R., Baron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., & Pfaller, M. A. (2007). Manual of Clinical Microbiology (9th ed.). ASM Press.
  2. Winn, W., Allen, S., Janda, W., Koneman, E., Procop, G., Schreckenberger, P., & Woods, G. (2006). Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology (6th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
  3. BioMérieux. (n.d.). API Identification Products. Consulté à partir du site officiel de BioMérieux.
  4. Galeries d'identification API - Diagnostic Clinique | bioMérieux France (biomerieux.fr)

Mise au point d’un échantillon d’eau venu de l’espace de prototypage de la cuve de la découpeuse laser (Omax) sur un milieu LB

Informations :

·         Alan Kernanec

·         alan.kernanec@sorbonne-universite.fr

·         27/05/24

Contexte :

Nous voulons voir si l’échantillon d’eau qui provient de l’espace prototypage contient des bactéries ou des colonies spécifiques.

 

Objectifs :

Nous avons fait des tests sur un milieu gélosé LB qui est composé d'agar-agar, de LB et d’eau distillée.

 

Consommables :

·         Agar-Agar

·         LB

·         Eau distillée

·         Cristal violet

·         Lugol

·         Ethanol

·         Fuchsine

·         Javel

 

Matériel et Machines utilisés :

·         Tube à essai

·         Ense de platine

·         P1000

·         Pipette pasteur en verre

·         Bécher

·         Bec bunsen

·         Agitateur magnétique

·         Boîte de pétri

·         Lame de microscope

·         Pince

·         Bac en verre

·         Microscope

·         Portoir

·         Poubelle DASRI

·         Balance de précision

 

Protocole :

 

1-    Préparation du milieux LB de volume 200mL dans une bouteille en verre.

2-    Mettre la bouteille dans l’autoclave. Pour la préparation de l’autoclave mettre un fond d’eau distillée au fond. Puis lancer le programme 20min à 121°C.

3-    Allumer la PSM et procéder au nettoyage de la surface. Par la suite annoter les boîtes de pétri (2 boîtes séparées en 6 parties et 2 boîtes en ensemencement en strie standard). Penser à mettre la date et la nature du milieu et rajouter T pour témoins et E pour échantillon.

4-    Par la suite, procéder au coulage des boîtes sous PSM et attendre qu’elles se solidifient.

5-    Puis procéder à l’ensemencement des boîtes comme indiqué ci-dessous :

image.png

6-    Puis mettre les boîtes retournées 24h à l’incubateur à 37°C.

7-    Observation des boîtes

8-    Lancer une coloration de Gram :

 

Procédure :

1.    Fixation : Fixer les bactéries sur une lame de verre en les chauffant légèrement. Cela peut être fait en passant la lame au-dessus d'une flamme.

image.pngimage.png

image.png

image.png

2.    Coloration initiale : Appliquer le cristal violet sur les bactéries. Laisser agir pendant environ 1 minute.

3.    Fixation du cristal violet : Ajouter le Lugol (solution d'iode) sur le cristal violet. Laisser agir pendant environ 1 minute. Cette étape fixe le cristal violet dans la paroi cellulaire.

4.    Décoloration : Laver la lame à l'éthanol ou à l'alcool éthylique. Cela élimine le cristal violet des bactéries. La durée de décoloration doit être surveillée attentivement, car elle varie selon les types de bactéries.

5.    Contre-coloration : Appliquer la fuchsine sur les bactéries. Laisser agir pendant 1 minutes. La fuchsine colore les bactéries qui ont perdu le cristal violet.

6.    Lavage final : Rincer la lame à l'eau pour éliminer l'excès de colorant.

7.    Observation : Observer les bactéries au microscope. Les bactéries qui conservent la coloration violette sont appelées "Gram-positives", tandis que celles qui prennent la coloration safranine sont appelées "Gram-négatives".

Résultats :

·         Gram-positif : Bactéries avec une paroi cellulaire épaisse qui retient le cristal violet.

·         Gram-négatif : Bactéries avec une paroi cellulaire plus mince qui ne retient pas le cristal violet et prend la coloration rose.

9-    Et nous observation au microscope des Bacillus violet. 

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Conclusion :

L'observation de Bacillus dans des échantillons d'eau met en évidence plusieurs aspects importants concernant la qualité de l'eau et la santé environnementale. Bacillus est un genre de bactéries largement répandu dans divers environnements aquatiques et terrestres, et sa présence peut avoir des implications variées :

  1. Indicateur de Contamination : La présence de certaines espèces de Bacillus peut indiquer une contamination de l'eau par des matières organiques ou des polluants. Ces bactéries peuvent provenir de sources agricoles, industrielles ou domestiques.
  2. Rôle Écologique : Bacillus joue un rôle crucial dans le cycle des nutriments en décomposant les matières organiques et en contribuant à la reminéralisation des éléments essentiels. Elles participent à la purification naturelle de l'eau.
  3. Potentiel Pathogène : Bien que la plupart des espèces de Bacillus soient inoffensives, certaines peuvent être pathogènes pour les humains, les animaux ou les plantes. La détection de telles espèces nécessite une attention particulière pour évaluer les risques sanitaires potentiels.
  4. Utilisation Biotechnologique : Les bactéries du genre Bacillus sont souvent utilisées dans des applications biotechnologiques en raison de leurs capacités enzymatiques et de leur résistance à des conditions environnementales difficiles. Elles peuvent être employées dans le traitement des eaux usées, la bioremédiation et la production de produits biologiques.

En conclusion, la présence de Bacillus dans l'eau doit être interprétée en fonction du contexte environnemental et des spécificités de chaque espèces détectées. Une analyse détaillée et continue est essentielle pour évaluer correctement l'état de l'eau et prendre les mesures appropriées pour maintenir la qualité de l'eau et protéger la santé publique.

Nous avons fait un nouveau test mais cette fois-ci sur Milieu TSA. Nous avons fait la même manipulation, une a eu lieu le 28/05/24 et l'autre le 05/06/24. Et nous avons procédé a un zéro, des témoins et des échantillons (cela reste des échantillons d'eau qui proviennent de l'espace du prototypage). De plus, nous avons remarqué que le milieu TSA était plus adéquat que le milieu LB. Nous avons pu le voir avec le nombre de colonie sur les boîtes de pétri.

Et voici ce que l'on a obtenu :

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Technique de stérilisation au micro ondes

Technique de stérilisation au micro ondes

Generalites

Dans ce page, nous explorons l’utilisation des micro-ondes pour l'élimination de divers pathogènes et comparons cette méthode à d'autres techniques de stérilisation afin d'évaluer son efficacité. 

Avant d'analyser ses performances, il est essentiel de définir les termes clés relatifs à la stérilisation et d'établir les conditions nécessaires à sa mise en œuvre.

Le concept de « vie ou mort » des micro-organismes se réfère ici à leur incapacité à répliquer leur matériel génétique. La stérilisation est définie comme l’application de méthodes et de moyens visant à éliminer par destruction tous les micro-organismes, quelle que soit leur nature ou forme, sur un objet préalablement nettoyé.

Pour qu'un dispositif médical soit étiqueté « stérile », la probabilité théorique de la présence d'un micro-organisme viable doit être égale ou inférieure à 1 sur 106 . Il est important de noter que seule une surface propre peut être efficacement stérilisée. La pré-désinfection est donc une étape fondamentale pour éliminer les résidus organiques avant d'entamer le processus de stérilisation.

Stérilisation par micro-ondes vs autoclave 

Autoclave:

La stérilisation par autoclave (vapeur) consiste en l'élimination des pathogenes par l'elevation de pression et temperature pour denaturer le DNA et detruire les enzymes pour tuer les ycrobes de la surface des appareils. 

Dans la stérilisation à la vapeur, un dispositif emballé est placé dans un autoclave où de la vapeur sous pression à 121 °C le stérilise pendant une durée déterminée. Ce processus, caractérisé par des températures et une humidité élevées, convient à des matériaux comme le verre, les métaux, le papier et certains polymères (par exemple, silicone, polyuréthane, polycarbonate) qui supportent ces conditions. Cependant, il peut corroder certains métaux et est incompatible avec les matériaux ayant des points de fusion ou de ramollissement bas.

Pour une stérilisation efficace, la vapeur doit pénétrer l'emballage et transférer uniformément la chaleur à toutes les surfaces du dispositif. Un emballage poreux (en papier) permet à la vapeur d'entrer tout en bloquant les micro-organismes. Les obstacles tels que les poches d'air, les contaminants (saleté, graisse) ou certains éléments de conception (joints toriques, chemins complexes) peuvent réduire l'efficacité, mais ces problèmes peuvent être atténués par une conception minutieuse du dispositif. Les dispositifs plus lourds nécessitent plus de temps pour atteindre les températures de stérilisation efficaces, mais les matériaux à haute conductivité thermique accélèrent le transfert de chaleur.

Principaux avantages :

  • Processus simple, avec un contrôle de processus possible (grâce à l'intégration de la létalité, à partir de l'accumulation des augmentations de température) ; temps d'exposition relativement courts ; coût relativement faible.
  • Capable de stériliser de nombreux liquides.
  • Méthode largement disponible et utilisée, capable de stériliser de nombreux dispositifs réutilisables.
  • Absence de résidus toxiques.
  • Peut stériliser des aliments et de nombreux médicaments.
  • Efficace et rapide (temps de cycle court).
  • Pénètre les emballages denses poreux, les emballages médicaux et les lumières.

Principaux inconvénients :

  • Température élevée ; incompatible avec de nombreux polymères et matériaux sensibles à la chaleur et à l'humidité.
  • Peut corroder et ternir les instruments, provoquant la rouille de certains d'entre eux.
  • Moins pénétrable que l'oxyde d'éthylène (EO) et l'irradiation.
  • L'air peut constituer une barrière à la diffusion de la vapeur.
  • Ne peut pas stériliser les poudres et les huiles.
  • Risque de brûlures potentielles (par exemple, pour des matériaux non refroidis)

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Cette machine est disponible dans l'espace biologie-chimie du FABLAB SU. Plus d'information


Stérilisation par micro-ondes:


La stérilisation par micro-ondes repose sur une combinaison de broyage et de chauffage rapide des instruments, utilisant des ondes électromagnétiques pour chauffer les matériaux de l'intérieur. Ce procédé permet d'atteindre une inactivation bactérienne supérieure à 8 log10 en seulement 30 minutes, grâce à des paramètres optimisés comme la puissance et la durée d'exposition.

Matériaux Compatibles et Non Compatibles

Les matériaux les plus appropriés pour ce type de stérilisation sont ceux qui résistent aux températures élevées sans se dégrader ni se déformer. Les matériaux compatibles incluent :

  • Métaux résistants (placés de manière à éviter les arcs électriques),
  • Céramiques et certains types de verre,
  • Polymères thermorésistants, tels que le polypropylène et le polyéthylène téréphtalate (PET), ainsi que des matériaux spécifiques pour les applications médicales et de laboratoire.

Matériaux à éviter :

  • Plastiques sensibles à la chaleur (par ex., polystyrène), susceptibles de fondre ou de dégager des substances toxiques,
  • Matériaux non adaptés aux micro-ondes, tels que certains métaux purs ou alliages pouvant produire des étincelles.

Puissance et Durée Optimales

L'efficacité de la stérilisation dépend de la puissance des micro-ondes, généralement entre 500 et 1000 watts pour des applications standard. Les recommandations de temps et puissance varient en fonction des matériaux :

  • Verres et céramiques : 500-700 watts pendant 15 à 20 minutes sont suffisants pour décontaminer des instruments simples sans composants organiques.
  • Polymères résistants : 600-800 watts pendant 10 à 15 minutes pour les petits dispositifs ; pour des objets plus volumineux ou complexes, un temps plus long et une puissance de 800-1000 watts sont recommandés.

Optimisation et Distribution de la Chaleur

Pour une stérilisation uniforme, il est recommandé d'utiliser des équipements dotés de mécanismes de mélange ou d'agitation des matériaux. Certains systèmes sont équipés de plateaux rotatifs ou de dispositifs de brassage pour une meilleure répartition de la chaleur. L'ajout de modules de suivi de la température en temps réel peut également améliorer la sécurité et l'efficacité du procédé.

Conditions Idéales d'Utilisation

  • Température ambiante stable : La pièce doit être bien ventilée, avec une température ambiante constante.
  • Contrôle d’humidité : Des réglages de déshumidification peuvent être ajoutés pour éviter l'humidité résiduelle et ainsi réduire le risque de développement microbien post-traitement.
  • Équipements de protection : En raison des températures élevées générées, le port de gants et de lunettes de protection est essentiel pour manipuler les dispositifs après traitement. 

Principaux avantages :

  • Respect de l'environnement : Technologie généralement moins énergivore que les méthodes traditionnelles, réduisant ainsi l'empreinte écologique.
  • Rapidité d'action : Permet des temps de traitement courts, souvent inférieurs à 30 minutes, pour une inactivation efficace des agents pathogènes.
  • Simplicité d'utilisation : Les systèmes de stérilisation par micro-ondes sont souvent conçus pour être utilisés par des opérateurs non qualifiés, ce qui facilite leur mise en œuvre.
  • Maintenance économique : Les coûts d'entretien peuvent être inférieurs par rapport à d'autres technologies comme l'incinération ou les autoclaves.
  • Traçabilité : Beaucoup de systèmes modernes offrent des options de traçabilité, permettant l'enregistrement et le suivi des opérations de désinfection.
  • Efficacité de décontamination : Capable d'atteindre des niveaux élevés d'inactivation microbiologique, dépassant souvent les exigences de stérilisation.
  • Réduction du volume et du poids : Les déchets sont souvent réduits en volume et en poids, facilitant leur gestion et leur élimination ultérieure.

Principaux inconvénients :

  • Limites de compatibilité : Certains matériaux sensibles à la chaleur peuvent ne pas être adaptés à cette méthode.
  • Efficacité variable : Peut être moins efficace pour des matériaux très compacts ou des déchets à forte densité, où la chaleur peut avoir du mal à pénétrer uniformément.
  • Dépendance à l'électricité : Nécessite une source d'énergie électrique stable, ce qui peut être problématique dans certaines situations.
  • Risque de brûlures : Les matériaux non conçus pour résister à des températures élevées peuvent être endommagés ou provoquer des brûlures.

Bibliographie: