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wiki:projets:bacteries_bioluminescents [2018/02/23 14:02]
anabely |
wiki:projets:bacteries_bioluminescents [2020/10/05 14:39] (Version actuelle)
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| Porteur du projet: **Anabely Gutierrez** --- //[[anabelydeut@hotmail.com|anabely]] // | Porteur du projet: Anabely Gutierrez --- //[[anabelydeut@hotmail.com|anabely]] // et Maritzaida Varela ([[maritzaidavarela@gmail.com|contact]])\\ |
| **Maritzaida Varela** --- //[[maritzaidavarela@gmail.com]] // | |
| Si vous souhaitez participer à ce projet une fois conçu, n'hésitez pas à me contacter! | Si vous souhaitez participer à ce projet une fois conçu, n'hésitez pas à me contacter! |
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| <color #ed1c24>R-CHO + FMNH2</color> + O2 –[<color #22b14c>LUCIFERASE</color>] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm | <color #ed1c24>R-CHO + FMNH2</color> + O2 –[<color #22b14c>LUCIFERASE</color>] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm |
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| **Comment cette réaction est possible dans les bactéries ?** | **Comment cette réaction est possible dans les bactéries ?** |
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| Dans les bactéries cette réaction est possible en activant les gènes correspondants en absence de lumière, ces gènes (cassette LuxR) activent : | Dans les bactéries cette réaction est possible en activant les gènes correspondants en absence de lumière, ces gènes (cassette LuxR) activent : |
| Fig.2: | Fig.2: |
| A. Schéma de la biosynthèse faite par la catalyse de l'oxydoréduction de la <color #22b14c>luciférase</color>, le FMNH2 est oxydé en FMN et l'aldéhyde aliphatique est oxydé en acide gras. | A. Schéma de la biosynthèse faite par la catalyse de l'oxydoréduction de la <color #22b14c>luciférase</color>, le FMNH2 est oxydé en FMN et l'aldéhyde aliphatique est oxydé en acide gras. |
| B. Image du gène LuxR exprimé dans une bactérie. | B. Image iconographique du gène LuxR exprimé dans une bactérie. |
| </WRAP> | </WRAP> |
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| <fs x-large><color #ff7f27>**Principe**</color></fs> | <fs x-large><color #ff7f27>**Principe**</color></fs> |
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| * <fs large>Le principe réside en transformer les bactéries //d'Escherichia coli//. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement | * <fs large>Le principe réside en transformer les bactéries //d'Escherichia coli//. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement |
| au CaCl2</fs>. | au CaCl2</fs>. |
| * <fs large>L’ADN ajouté se fixera sur les bactéries.</fs> | * <fs large>L’ADN ajouté se fixera sur les bactéries.</fs> |
| * <fs large>Ensuite elles sont gardées sur glace, ce qui fige les membranes (~ 4°C).</fs> | * <fs large>Ensuite elles sont gardées sur glace, ce qui fige les membranes (~ 4°C).</fs> |
| * <fs large>Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR).</fs> | * <fs large>Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR).</fs> |
| * <fs large>Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN).</fs> | * <fs large>Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN).</fs> |
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| <note><fs medium>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</fs></note> | <note><fs medium>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</fs></note> |
| * Portoir tube eppendorf | * Portoir tube eppendorf |
| * centrifugeuse | * centrifugeuse |
| * <color #ff7f27>Bloc chauffant permettant conserver les bactéries à 42°C</color> | * Bloc chauffant permettant conserver les bactéries à 42°C |
| * <color #ff7f27>Poudre Luria Broth (LB) et Luria Broth Agar (LA)</color> | * Poudre Luria Broth (LB) et Luria Broth Agar (LA) |
| * Boite tubes Eppendorf 1,5 ml | * Boite tubes Eppendorf 1,5 ml |
| * <color #ed1c24>Plasmide lux117 ou pVH-luxO </color> | * Plasmide plux117 |
| * <color #ff7f27>Boîtes de Petri LA</color> <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit</fs> | * Boîtes de Petri LA |
| * <color #ff7f27>Boîtes de Petri LA + ampicilline</color> <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit</fs> | * Boîtes de Petri LA + ampicilline <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit</fs> |
| * <color #ed1c24>Cellules //d'Escherichia coli (DH5a )//</color> <fs xx-small>lien: http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</fs> | * Cellules //d'Escherichia coli (DH5a ou T10)// |
| * <color #ff7f27>Milieu LB liquide</color> <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit</fs> | * Milieu LB liquide <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit</fs> |
| * <color #ed1c24>Sac rouge pour les déchets</color> | * Sac rouge pour les déchets |
| * <color #ff7f27>CaCl2 FROID (0.5M)</color> <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit | * CaCl2/RbCl (froid à 0.5M) <fs xx-small>lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit |
| </fs> | </fs> |
| </WRAP> | </WRAP> |
| <fs large>La première procédure c'est de rendre les bactéries compétentes (c'est à dire que l'on s'assure que son état physiologique garantira une efficacité maximum de transformation et ensuite on procédera à les transformer (insertion d'ADN de la luciférase). | <fs large>La première procédure c'est de rendre les bactéries compétentes (c'est à dire que l'on s'assure que son état physiologique garantira une efficacité maximum de transformation et ensuite on procédera à les transformer (insertion d'ADN de la luciférase). |
| </fs> | </fs> |
| <note important><fs large>Attention ! : Toutes les manipulations de type microbiologique se feront stérilement, inclus le matériel.</fs></note> | <note important><fs large>Attention ! : Toutes les manipulations de type microbiologique se feront **stérilement, inclus le matériel**.</fs></note> |
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| - <fs large>Prendre une culture d’une nuit de bactéries //Escherichia coli (DH5a)//. Diluer cette culture 1/100 fois dans 40 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 250 ml. Agiter | - <fs large>Prendre une culture d’une nuit de bactéries //Escherichia coli (DH5a/T10)//. Diluer cette culture 1/100 fois dans 40 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 250 ml. Agiter |
| vigoureusement à 37°C .</fs> | vigoureusement à 37°C .</fs> |
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| <note important><fs large>Attention : à partir de ce moment, la culture et le matériel à manipuler doit être froid sous la glace (~4°C)</fs></note> | <note important><fs large>Attention : à partir de ce moment, la culture et le matériel à manipuler doit être **froid sous la glace (~4°C)**</fs></note> |
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| - <fs large>Après environ 3 heures, vérifier la densité optique de la culture. Quand la densité optique (DO600) est entre 0.5 et 0.6, mettre l'Erlenmeyer contenant les bactéries dans la glace</fs>. | - <fs large>Après environ 3 heures, vérifier la densité optique de la culture. Quand la densité optique (DO600) est entre 0.5 et 0.6, mettre l'Erlenmeyer contenant les bactéries dans la glace</fs>. |
| - <fs large>Prélever 1.5 ml de culture et les transférer dans 1 tube Eppendorf 1.5 ml. Marquer ce tube avec un <color #ed1c24>**+**</color>. Prélever 1.5 ml dans un autre tube Eppendorf. Marquer ce tube avec un <color <color #00a2e8>**-**</color>. L’ADN sera mis dans le tube marqué <color #ed1c24>**+**</color>. Le tube marqué <color #00a2e8>**-**</color> servira de contrôle</fs>. | - <fs large>Prélever 1.5 ml de culture et les transférer dans 1 tube Eppendorf 1.5 ml. Marquer ce tube avec un <color #ed1c24>**+**</color>. Prélever 1.5 ml à nouveau de culture et le transférer dans un autre tube Eppendorf. Marquer ce tube avec un <color <color #00a2e8>**-**</color>. L’ADN sera mis dans le tube marqué <color #ed1c24>**+**</color>. Le tube marqué <color #00a2e8>**-**</color> servira de contrôle</fs>. |
| - <fs large>Centrifuger les tubes Eppendorf 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules</fs>. | - <fs large>Centrifuger les tubes Eppendorf 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules</fs>. |
| - <fs large>Jeter le surnageant</fs>. | - <fs large>Jeter le surnageant</fs>. |
| - <fs large>Ajouter 1 ml de CaCl2 0.05M froid sur le culot et le **resuspendre doucement** en utilisant la pipette P1000</fs>. | - <fs large>Ajouter 1 ml de CaCl2 ou/et RbCl à 0.05M froid sur le culot et le **resuspendre doucement** en utilisant la pipette P1000</fs>. |
| | - Ne pas tenir en compte les volumes et concentrations pour cette étape préalable à la transformation (tenir en compte pour l'ajout d'antibiotique en milieu liquide LB). |
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| <note important><fs large>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</fs></note> | <note important><fs large>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</fs></note> |
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| - <fs large>Centrifuger les tubes comme avant. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100 µl de **CaCl2 0.05M froid**</fs>. | - <fs large>Centrifuger les tubes comme avant. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100 µl de **CaCl2/RbCl à 0.05M froid**</fs>. |
| - <fs large>Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l'emploi ("compétentes" pour la transformation)</fs>. | - <fs large>Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l'emploi ("compétentes" pour la transformation)</fs>. |
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| <WRAP center round box 40%> | <WRAP center round box 40%> |
| **Déposer et étaler:** | **Déposer et étaler:** |
| - <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp</fs> | - <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp</fs> |
| - <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA</fs> | - <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA</fs> |
| - <fs large>0.1 ml du tube – sur une boîte LA+ Amp</fs> | - <fs large>0.1 ml du tube – sur une boîte LA+ Amp</fs> |
| - <fs large>0.1 ml du tube – sur une boîte LA</fs> | - <fs large>0.1 ml du tube – sur une boîte LA</fs> |
| | LA : Luria Broth Agar, Amp: ampicilline |
| </WRAP> | </WRAP> |
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| * <fs large>Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant</fs> | * <fs large>Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant</fs> |
| * <fs large>Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une **boite LA + Amp.**</fs> | * <fs large>Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une **boite LA + Amp.**</fs> |
| * Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h.</fs> Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et incubées la nuit à 37°C juste avant de les observer. | * <fs large>Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h. Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et incubées la nuit à 37°C juste avant de les observer. </fs> |
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| * | {{ :wiki:projets:testbio.png?nolink |}} |
| {{ :wiki:projets:testbio.jpg?nolink |}} | |
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| <fs x-large>**<color #ff7f27>Résultats:</color> **</fs> | <fs x-large>**<color #ff7f27>Résultats:</color> **</fs> |
| * Protopedia Life 3D. 4 juillet 2017, page consulté 7734 fois. link: http://proteopedia.org/wiki/index.php/Luciferase | * Protopedia Life 3D. 4 juillet 2017, page consulté 7734 fois. link: http://proteopedia.org/wiki/index.php/Luciferase |
| * Brenda; The Comprehensive Enzyme Information System. Janvier 2018. link : http://www.brenda-enzymes.org/taxonomy.php?f[id][value]=669 | * Brenda; The Comprehensive Enzyme Information System. Janvier 2018. link : http://www.brenda-enzymes.org/taxonomy.php?f[id][value]=669 |
| | * Polycopié LV301, Stéphane Debernard, 2012. |
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| </fs></ff> | </fs></ff> |
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| | * <color #22b14c>19/03/18</color> |
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| | <color #00a2e8>**Définition des OGM**</color> |
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| | La directive 90-219 concernant uniquement les micro-organismes a été transposée en droit français de façon plus étendue à l'ensemble des organismes génétiquement modifiés et non aux seuls micro-organismes génétiquement modifiés (M.G.M.). |
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| | La loi s'applique donc aux organismes génétiquement modifiés (O.G.M.) . Il faut entendre par « organisme », toute entité biologique non cellulaire ou multicellulaire, capable de se reproduire ou de transférer du matériel génétique; cette définition englobe les micro-organismes, y compris les virus, précise l'article 1er a) de cette même loi (directive 90-219). |
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| | A chaque fois qu'est mentionnée dans un texte l'expression "organismes génétiquement modifiés"(O.G.M.), il faut entendre "y compris les micro-organismes"(M.G.M.)" |
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| | La loi cependant ne s'applique pas à tous les organismes génétiquement modifiés. |
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| | L'article 1er b) de la loi définit l'organisme génétiquement modifié comme un "organisme dont le matériel génétique a été modifié autrement que par multiplication ou recombinaisons naturelles". |
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| | * Le décret 93-774 complète cette définition en spécifiant en son article 1er que sont concernés notamment les O.G.M. obtenus par trois types de techniques : |
| | - Les techniques de recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN), visées par la recommandation 82/472/CEE, qui utilisent des systèmes vectoriels. |
| | - Les techniques impliquant l'incorporation directe dans un micro- organisme ou un organisme de matériaux héréditaires préparés à l'extérieur du micro- organisme, ou de l'organisme, y compris la micro-injection et la micro-encapsulation. |
| | - Les techniques de fusion cellulaire (y compris la fusion de protoplastes) ou d'hybridation dans lesquelles des cellules vivantes présentant de nouvelles combinaisons de matériaux génétiques héréditaires sont constitués par la fusion de deux cellules ou davantage, au moyen de méthodes ne survenant pas naturellement". Sont en revanche écartés du champ d'application de la loi, les organismes génétiquement modifiés "obtenus par des techniques qui ne sont pas considérées, de par leur caractère naturel, comme entraînant une modification génétique ou par celles qui ont fait l'objet d'une utilisation traditionnelle sans inconvénient avéré pour la santé publique ou l'environnement". |
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| | * L'article 2 de la loi complété par l'article 2 du même décret 93-774 excluent donc : Les organismes obtenus par plusieurs techniques telles que : |
| | - La fécondation in vitro ; |
| | - La conjugaison, la transduction, l'infection virale, la transformation ou tout autre processus naturel ; |
| | - L'induction polyploïde à condition qu'elles ne fassent pas appel aux techniques de recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou à des organismes génétiquement modifiés" |
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| | * (article 2-I) ; – les organismes obtenus par plusieurs techniques telles que |
| | - La mutagenèse; |
| | - La formation et l'utilisation d'hybridomes animaux somatiques ; |
| | - La fusion cellulaire, y compris la fusion de protoplastes, de cellules provenant de végétaux pouvant être produits par des méthodes de culture ou de multiplication traditionnelles ; |
| | - L’auto-clonage de micro-organismes non pathogènes survenant de façon naturelle et répondant aux critères du groupe I pour les micro-organismes récepteurs. |
| | - L'infection de cellules vivantes par les virus, viroïdes ou prions à condition qu'elles ne comportent pas l'utilisation d'O.G.M. en tant qu'organismes récepteurs ou parentaux" (article 2-II). |
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| | * <color #22b14c>04/04/18</color> |
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| | <color #00a2e8>**Design des panneaux ou lettres**</color> |
| | {{ :wiki:projets:lettrage3d.png?800 |}} |
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| | Une fois que la transformation des bactéries est réussie, la souche bactérienne transformée est régulièrement repiquée stérilement sur agar nutritif. Pour cela, un échantillon est prélevé avec une anse stérile et étalé en stries à la surface du milieu. Les boîtes de Pétri sont ensuite mises à incuber à la température du GL. |
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| | La bioluminescence adaptée au design du lettrage se fera dans un milieu liquide LB plus ampicilline. |
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| | La bioluminescence se développe en général au bout de 18 à 24 h et se maintient de deux à quatre jours. En repiquant la souche régulièrement, on dispose en permanence de cultures prêtes à l’emploi car dès que la luminescence des boîtes devient visible, elles sont placées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’emploi. Après sortie du réfrigérateur, les capacités de bioluminescence sont pratiquement inchangées et se manifestent dès le retour à température ambiante. |
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| | Pour des résultats plus optimales on peut améliorer la technique de bioluminescence en **ajoutant un opéron lactose+IPTG** afin de transcrire en continu de la luminescence. |
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| | <fs large>**Résultats à comparer avec la bioluminescence de cette transgenèse.**</fs> |
| | {{ :wiki:projets:superposition_lettres_.jpg?1200 |}} |
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| | * <color #22b14c>10/04/18</color> |
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| | <color #00a2e8>**Culture en milieu liquide**</color> |
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