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wiki:projets:bacteries_bioluminescents

Différences

Ci-dessous, les différences entre deux révisions de la page.

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wiki:projets:bacteries_bioluminescents [2018/04/04 15:06]
anabely [Journal et suivi de l'expérience:] 		wiki:projets:bacteries_bioluminescents [2020/10/05 14:39] (Version actuelle)
Ligne 31: Ligne 31:
 <color #ed1c24>R-CHO + FMNH2</color> + O2 –[<color #22b14c>LUCIFERASE</color>] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm <color #ed1c24>R-CHO + FMNH2</color> + O2 –[<color #22b14c>LUCIFERASE</color>] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm
  
-**Comment cette réaction est possible dans les bactéries ?** +  **Comment cette réaction est possible dans les bactéries ?** 
  
 Dans les bactéries cette réaction est possible en activant les gènes correspondants en absence de lumière, ces gènes (cassette LuxR) activent :  Dans les bactéries cette réaction est possible en activant les gènes correspondants en absence de lumière, ces gènes (cassette LuxR) activent : 
Ligne 68: Ligne 68:
 <fs x-large><color #ff7f27>**Principe**</color></fs> <fs x-large><color #ff7f27>**Principe**</color></fs>
  
-* <fs large>Le principe réside en transformer les bactéries //d'Escherichia coli//. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement +  * <fs large>Le principe réside en transformer les bactéries //d'Escherichia coli//. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement 
     au CaCl2</fs>.     au CaCl2</fs>.
-* <fs large>L’ADN ajouté se fixera sur les bactéries.</fs> +  * <fs large>L’ADN ajouté se fixera sur les bactéries.</fs> 
-* <fs large>Ensuite elles sont gardées sur glace, ce qui fige les membranes (~ 4°C).</fs> +  * <fs large>Ensuite elles sont gardées sur glace, ce qui fige les membranes (~ 4°C).</fs> 
-* <fs large>Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR).</fs> +  * <fs large>Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR).</fs> 
-* <fs large>Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN).</fs> +  * <fs large>Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN).</fs> 
  
 <note><fs medium>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</fs></note> <note><fs medium>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</fs></note>
Ligne 134: Ligne 134:
   - <fs large>Jeter le surnageant</fs>.   - <fs large>Jeter le surnageant</fs>.
   - <fs large>Ajouter 1 ml de CaCl2 ou/et RbCl à 0.05M froid sur le culot et le **resuspendre doucement** en utilisant la pipette P1000</fs>.   - <fs large>Ajouter 1 ml de CaCl2 ou/et RbCl à 0.05M froid sur le culot et le **resuspendre doucement** en utilisant la pipette P1000</fs>.
-  - Ne pas tenir en compte des volumes et des concentrations pour cette étape préalable à la transformation (tenir compte pour l'ajout d'antibiotique en milieu liquide LB)+  - Ne pas tenir en compte les volumes et concentrations pour cette étape préalable à la transformation (tenir en compte pour l'ajout d'antibiotique en milieu liquide LB).
  
 <note important><fs large>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</fs></note> <note important><fs large>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</fs></note>
Ligne 159: Ligne 159:
  
 <WRAP center round box 40%> <WRAP center round box 40%>
-**Déposer et étaler:**+  **Déposer et étaler:**
   -  <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp</fs>   -  <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp</fs>
   -  <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA</fs>   -  <fs large>0.1 ml du tube + sur une boîte LA</fs>
Ligne 232: Ligne 232:
 </fs></ff> </fs></ff>
  
- * <color #22b14c>19/03/18</color>+  * <color #22b14c>19/03/18</color>
  
 <color #00a2e8>**Définition des OGM**</color> <color #00a2e8>**Définition des OGM**</color>
Ligne 263: Ligne 263:
   - L'infection de cellules vivantes par les virus, viroïdes ou prions à condition qu'elles ne comportent pas l'utilisation d'O.G.M. en tant qu'organismes récepteurs ou parentaux" (article 2-II).    - L'infection de cellules vivantes par les virus, viroïdes ou prions à condition qu'elles ne comportent pas l'utilisation d'O.G.M. en tant qu'organismes récepteurs ou parentaux" (article 2-II). 
  
-* <color #22b14c>04/04/18</color>+  * <color #22b14c>04/04/18</color>
  
 <color #00a2e8>**Design des panneaux ou lettres**</color> <color #00a2e8>**Design des panneaux ou lettres**</color>
-{{ :wiki:projets:lettrage3d.jpg?1000 |}}+{{ :wiki:projets:lettrage3d.png?800 |}}
  
-Une fois que la transformation des bactéries est réussie, la souche bactérienne transformée est régulièrement repiquée stérilement sur agar nutritif. Pour cela, un échantillon est prélevé avec une anse stérile et étalé en stries à la surface du milieu. Les boîtes de Pétri sont ensuite mises à incuber à la température du GL. La bioluminescence se développe en général au bout de 18 à 24 h, dès que la luminescence des boîtes devient visible, elles sont placées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’emploi. Après sortie du réfrigérateur, les capacités de bioluminescence sont pratiquement inchangées et se manifestent dès le retour à température ambiante. +Une fois que la transformation des bactéries est réussie, la souche bactérienne transformée est régulièrement repiquée stérilement sur agar nutritif. Pour cela, un échantillon est prélevé avec une anse stérile et étalé en stries à la surface du milieu. Les boîtes de Pétri sont ensuite mises à incuber à la température du GL.  
-Résultats à comparer avec la bioluminescence de cette transgenèse.+ 
 +La bioluminescence adaptée au design du lettrage se fera dans un milieu liquide LB plus ampicilline. 
 + 
 +La bioluminescence se développe en général au bout de 18 à 24 h et se maintient de deux à quatre jours. En repiquant la souche régulièrement, on dispose en permanence de cultures prêtes à l’emploi car dès que la luminescence des boîtes devient visible, elles sont placées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’emploi. Après sortie du réfrigérateur, les capacités de bioluminescence sont pratiquement inchangées et se manifestent dès le retour à température ambiante. 
 + 
 +Pour des résultats plus optimales on peut améliorer la technique de bioluminescence en **ajoutant un opéron lactose+IPTG** afin de transcrire en continu de la luminescence.  
 + 
 + 
 +<fs large>**Résultats à comparer avec la bioluminescence de cette transgenèse.**</fs>
 {{ :wiki:projets:superposition_lettres_.jpg?1200 |}} {{ :wiki:projets:superposition_lettres_.jpg?1200 |}}
  
 +  * <color #22b14c>10/04/18</color>
  
 +<color #00a2e8>**Culture en milieu liquide**</color>
  
  
wiki/projets/bacteries_bioluminescents.1522854371.txt.gz · Dernière modification: 2018/04/04 15:06 de anabely

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