**Protocole Western Blot : **

^                                ^ Plantes protéines P5CS           ^
| 1 ) Extraction des Protéines   |      |
| *  Tampon d’extraction        | TrisHCl pH 6,8 100mM, 2mL de Glycérol 100%, 2mL de SDS 20% et complété en quantité suffisante pour 10mL avec de l’eau distillée |
|2) Gels et migrations           |      |
| *  Resolving 8%                | 3,05mL d’eau, 650µL d’acrylamide, 1,25mL de tris-HCL 0,5M, 50µL de SDS 10%, 25µL d’APS 10% et 10µL de TEMED |
| *  Stacking 4%                | 4,7mL d’eau, 2,7mL d’acrylamide, 2,5mL de tris-HCl 1,5M, 100µL de SDS 10%, 50µL d’APS 10% et 12,5µL de TEMED |
|3) Tampon et transfert          |      |
| *  Tampon de transfert BSN    | 5,82g de tris base, 2,93g Glycine, 200mL d’éthanol absolu, 3,75mL de SDS 10% et complété en quantité suffisante pour 1L avec de l’eau distillée |
| *  Sandwich de transfert horizontal    | Nitrocellulose + papier Wattman |
|4) Blocage          |      |
| *  tampon de blocage    | T1+tween BSA : 0,05M de TrisHCl, 2,5% de NaCl(w/v), 0,1% de BSA et 0,05% de Tween-20 pH 7,4 |
| *  rinçages    | 2 rapides + 4 de 10min au T1+tween |
|5) Incubation          |      |
| *  anticorps primaire    | dilué au 1/1000 |
| *  rinçages    | 2 rapides + 4 de 10min au T1+tween |
| *  anticorps secondaire    | couplé à une peroxydase dilué au 1/8000 |
| *  rinçages    | 2 rapides + 3 de 10min au T1+tween + 1 de 20min au T1 |
|6) Révélation          |      |
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