Bioluminescence Bactérienne

Chez les bactéries, la luciférase catalyse l’oxydation de la riboflavine mononucléotide réduite (FMNH2) et une longue chaîne d’aldéhyde (R-CHO), générant une flavine oxydée (FMN), un acide gras (R-COOH), de l’eau (H2O) et de la lumière (490-500 nm).

R-CHO + FMNH2 + O2 –[LUCIFERASE] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm

• *Comment cette réaction est possible dans les bactéries ? Dans les bactéries cette réaction est possible en activant les gènes correspondants en absence de lumière, ces gènes (cassette LuxR) activent :  * luxA et luxB qui codent pour la luciférase * luxCE qui codent pour un complexe enzymatique qui produit l'aldéhyde qui sert de substrat (RC(O)H) * luxD qui code pour la transferase La luciférine est constituée d'une flavine mononucléotide réduite (FNMH2) et d'un aldéhyde aliphatique de 8 à 14 atomes de carbone qui sert de cofacteur. Fig.2: A. Schéma de la biosynthèse faite par la catalyse de l'oxydoréduction de la luciférase, le FMNH2 est oxydé en FMN et l'aldéhyde aliphatique est oxydé en acide gras. B. Image iconographique du gène LuxR exprimé dans une bactérie. </WRAP> <note> Ce phénomène est historique! La bioluminescence est connu depuis l’antiquité. Aristote (348-322 av JC) parlait déjà de lumière émise par des poissons morts et des moisissures. A partir de 1600 diverses recherches permirent d’établir que cette réaction mettait en jeu une enzyme (la luciférase), un substrat oxydable (la luciférine) ainsi que l’oxygène. Au XVIIe siècle, Francis Bacon (1561-1626), René Descartes (1596-1650), Robert Hooke (1635-1703), puis Isaac Newton (1642-1727) font remarquer que le feu n'est pas l'unique source de lumière, car l'eau de mer, disent-ils, luit parfois lorsqu'elle est agitée par le passage d'un navire. </note> Objectif L’objectif c'est de faire une technique de transgenèse afin de créer une souche bioluminescente, grâce à l'expression du gène LuxR. Plus tard ces souches seront utilisés pour fabriquer des panneaux bioluminescents au GreenLab qui fonctionneront dans l'obscurité. Principe * Le principe réside en transformer les bactéries d'Escherichia coli. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement au CaCl2. * L’ADN ajouté se fixera sur les bactéries. * Ensuite elles sont gardées sur glace, ce qui fige les membranes (~ 4°C). * Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR). * Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN). <note>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</note> Plasmide p-lux 117, pVH-luxO Pour cette expérience nous allons utiliser le plasmide lux117. Celui-ci contient une origine de réplication (ori), un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline (ampR) ainsi que l’opéron lux (un opéron est une unité de transcription) provenant de la bactérie Vibrio harveyi. Cet opéron contient 5 gènes, luxA à luxE. Ils codent pour les protéines impliquées dans la réaction de bioluminescence. Le gène ampR code pour une enzyme (la ß-lactamase) capable d’inactiver les antibiotiques de la famille des pénicillines en clivant une liaison du noyau ß-lactame. Seules les bactéries possédant le gène ampR sont capables de croître sur un milieu contenant de l’ampicilline (antibiotique). Les colonies seront alors blanches et fluorescentes dans l'obscurité. Fig. 2 Carte de restriction de Lux117. L'opéron de Lux code pour la luciférase bactérienne ( luxAB ) et le complexe d'acide gras reductase ( luxCE ) qui est responsable de la biosynthèse pour la réaction luminescente.

  Matériel:

  • Micropipettes P20
  • Micropipettes P200
  • Micropipettes P1000
  • Boîte de pointes jaunes(2-200µl)
  • Boîte de pointes bleues(50-1000µl)
  • Boîte pipettes Pasteur pour les étalements
  • Portoir tube eppendorf
  • centrifugeuse
  • Bloc chauffant permettant conserver les bactéries à 42°C
  • Poudre Luria Broth (LB) et Luria Broth Agar (LA)
  • Boite tubes Eppendorf 1,5 ml
  • Plasmide plux117
  • Boîtes de Petri LA
  • Boîtes de Petri LA + ampicilline lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit
  • Cellules d'Escherichia coli (DH5a ou T10)
  • Milieu LB liquide lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit
  • Sac rouge pour les déchets
  • CaCl2/RbCl (froid à 0.5M) lien: https://docs.google.com/document/d/1CLuf3QNRh38TDgh1QbfYvEFvqQdm1u08oAvbNn1NA_o/edit

  Expérience Préparation des cellules compétentes:  La première procédure c'est de rendre les bactéries compétentes (c'est à dire que l'on s'assure que son état physiologique garantira une efficacité maximum de transformation et ensuite on procédera à les transformer (insertion d'ADN de la luciférase). <note important>Attention ! : Toutes les manipulations de type microbiologique se feront stérilement, inclus le matériel.</note> - Prendre une culture d’une nuit de bactéries Escherichia coli (DH5a/T10). Diluer cette culture 1/100 fois dans 40 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 250 ml. Agiter vigoureusement à 37°C . <note important>Attention : à partir de ce moment, la culture et le matériel à manipuler doit être froid sous la glace (~4°C)</note> - Après environ 3 heures, vérifier la densité optique de la culture. Quand la densité optique (DO600) est entre 0.5 et 0.6, mettre l'Erlenmeyer contenant les bactéries dans la glace. - Prélever 1.5 ml de culture et les transférer dans 1 tube Eppendorf 1.5 ml. Marquer ce tube avec un +. Prélever 1.5 ml à nouveau de culture et le transférer dans un autre tube Eppendorf. Marquer ce tube avec un -. L’ADN sera mis dans le tube marqué +. Le tube marqué - servira de contrôle. - Centrifuger les tubes Eppendorf  30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules. - Jeter le surnageant. - Ajouter 1 ml de CaCl2 ou/et RbCl à 0.05M froid sur le culot et le resuspendre doucement en utilisant la pipette P1000. - Ne pas tenir en compte les volumes et concentrations pour cette étape préalable à la transformation (tenir en compte pour l'ajout d'antibiotique en milieu liquide LB). <note important>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</note> - Centrifuger les tubes comme avant. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100 µl de CaCl2/RbCl à 0.05M froid. - Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l'emploi (“compétentes” pour la transformation). <note>Il est important que les solutions et les tubes soient gardés sur glace.Les cellules refroidies sont mises en contact d'une solution concentrée de chlorure de calcium. Le calcium chélate les phospholipides des membranes et participe à la rigidification des membranes à froid. De plus le calcium neutralise l'ADN transformant et lui permet de sédimenter au contact de la membrane avant son insertion dans la bactérie.</note> La transformation: * Ajouter 8 µl d’ADN (plasmide pLUX117) dans le tube marqué +. <note warning>Précautions pour garder l’ADN plasmidique intact 1-mettre des gants pour ouvrir le tube (protection contre les nucléases) 2-Le refermer immédiatement après emploi 3-Conserver constamment ce tube sur la glace surtout lors du passage d’un poste de travail à l’autre 4-Ne pas chauffer le tube dans la main ; ne pas le mettre près de la flamme 5-Ne pas le renverser</note> * Mettre le tube marqué + et le tube marqué - sur la glace pendant 15 minutes. * Incuber les tubes 90 secondes à 42°C (choc thermique) <note>Les membranes rigidifiées par la température basse et stabilisées par le CaCl2 vont s'ouvrir brièvement lors d'un choc thermique à 42 °C, et laisser passer l'ADN transformant. Les membranes se refermeront dès le choc thermique passé. Ce procédé est très destructeur et peu de bactéries y survivent, d'autre part peu de bactéries auront intégré un fragment d'ADN. La mortalité des cellules est très importante lors du choc thermique </note> * Replacer les tubes dans la glace pendant 5 minutes. * Ajouter 1 ml de LB (milieu nutritif) et incuber la suspension à 37°C pendant 30 minutes (pour l'expression de la résistance à l'ampicilline).

  • *Déposer et étaler: - 0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp - 0.1 ml du tube + sur une boîte LA - 0.1 ml du tube – sur une boîte LA+ Amp - 0.1 ml du tube – sur une boîte LA LA : Luria Broth Agar, Amp: ampicilline </WRAP> * Centrifuger le reste de la suspension 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules. * Enlever 0.7 ml de surnageant et le jeter. * Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant * Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une boite LA + Amp. * Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h. Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et incubées la nuit à 37°C juste avant de les observer. Résultats: Conclusions: Applications : La bioluminescence peut-être utilisée également comme indicateur de l'activité métabolique cellulaire et ainsi surveiller l'activité biologique et la toxicité des polluants, dans les projets de biorémediation. Pour quantifier l'activité métabolique on utilise la réaction de bioluminescence où elle fait intervenir 6 ATP pour chaque photon émis. L'ATP, est un indicateur de réactions biochimiques au sein d'un organisme vivant. Plus il y a de l'ATP et plus les organismes fonctionnent correctement et moins il y a “propagation” de toxicité dans les cellules au cours du temps. l' l’ATP c'est donc le réactif limitant dans toutes les expériences de ce type de dosage. D'autres applications s'inclinent aux biotechnologies vertes, qui ont utilisé le principe de cette transgenèse dans divers organismes tels que: * Symbiose de bactéries bioluminescentes (Glowee): Cette technique à été très innovatrice permettant d'obtenir de la lumière naturelle pendant maximum 72 heures. * Poissons Zebrafish (GloFish): Ce sont des poissons transgéniques commercialisés pour l'agrément, conçus à partir de protéines fluorescentes qui émettent une lumière verte lorsqu'elles sont exposés aux U.V. ou la lumière bleue. Extraites pour l'émission de la lumière verte chez la méduse Aequora victoria. Elles sont utilisées en biologie Moléculaire comme vecteurs d'expression génique et ont un impact importante dans la transgenèse. * Les techniques de bio-fluorescence sont devenues plus performantes, jusqu'à aboutir aux constructions artistiques, en faisant de la synthèse soustractive de couleurs. Références : * Wu, N., Rathnayaka, T. et Kuroda, Y. (2015). Expression bactérienne et ré-ingénierie de la luciférase de Gaussia princeps et son utilisation en tant que protéine rapporteur. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protéines et Protéomique, 1392-1399. * Nunes-Halldorson, V. da S. et Duran, NL (2003). Bactéries bioluminescentes: gènes lux en tant que biocapteurs environnementaux. Journal brésilien de microbiologie, No. 34. * Wiles, S., Ferguson, K., Stefanidou, M., Young, DB et Robertson, BD (2005). Luciferase alternative pour surveiller les cellules bactériennes dans des conditions défavorables. Applied and Environmental Microbiology 71, 3427-3432. * GST Fusion System Handbook. Edition AA. Ed: Amersham Biosciences, 2002. * Construction of a stable GFP-tagged Vibrio harveyi strain for bacterial dynamics analysis of abalone infection. Marie-Agnes Travers ;Annaıck Barbou ; Nelly Le Goıc ; Sylvain Huchette ; Christine Paillard ; Marcel Koken. Laboratoire des sciences de l’Environnement MARin, CNRS UMR 6539, Institut Universitaire Européen de la Mer, Université de Bretagne Occidentale, Plouzané , France. 14/10/2008. * Outils en Biologie. Beguin Claude, Brawand, Favet, Lombard F. Golshmidt M. Rossier C.Roux L. Scherly D. Schnieper L. Département de Biochimie, Faculté des Sciences, UniGe. link: https://www.bioutils.ch/ * Institut Français de l'éducation. site BIOTIC. La transgenèse link : http://acces.ens-lyon.fr/biotic/biomol/transgen/html/prepbac.htm * DH5-Alpha E.coli. link: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki * Protopedia Life 3D. 4 juillet 2017, page consulté 7734 fois. link: http://proteopedia.org/wiki/index.php/Luciferase * Brenda; The Comprehensive Enzyme Information System. Janvier 2018. link : http://www.brenda-enzymes.org/taxonomy.php?f[id][value]=669 * Polycopié LV301, Stéphane Debernard, 2012. —- ====== Journal et suivi de l'expérience: ====== * 14/02/18 Le plasmide sera certainement fourni par l’Université de Genève qui possède la souche Vibrio Harveyi. Vibrio Harveyi c'est une bactérie très pathogène dans le milieu marin chez les vertébrés et invertébrés, cette bactérie cause également de la pathogenèse chez l'ormeau, dont son mécanisme est inconnu. Dû à sa virulence et à la protéine ORM4 (souche pathogène fluorescente), elle exprime de façon important sa fluorescence. <ff Arial>Réf: Construction of a stable GFP-tagged Vibrio harveyi strain for bacterial dynamics analysis of abalone infection Marie-Agnès Travers ;Annaïck Barbou; Nelly Le Goïc; Sylvain Huchette; Christine Paillard; Marcel Koken. FEMS Microbiology Letters, Volume 289, Issue 1, 1 December 2008, Pages 34–40. </ff> * 19/03/18 Définition des OGM La directive 90-219 concernant uniquement les micro-organismes a été transposée en droit français de façon plus étendue à l'ensemble des organismes génétiquement modifiés et non aux seuls micro-organismes génétiquement modifiés (M.G.M.). La loi s'applique donc aux organismes génétiquement modifiés (O.G.M.) . Il faut entendre par « organisme », toute entité biologique non cellulaire ou multicellulaire, capable de se reproduire ou de transférer du matériel génétique; cette définition englobe les micro-organismes, y compris les virus, précise l'article 1er a) de cette même loi (directive 90-219). A chaque fois qu'est mentionnée dans un texte l'expression “organismes génétiquement modifiés”(O.G.M.), il faut entendre “y compris les micro-organismes”(M.G.M.)“  La loi cependant ne s'applique pas à tous les organismes génétiquement modifiés. L'article 1er b) de la loi définit l'organisme génétiquement modifié comme un “organisme dont le matériel génétique a été modifié autrement que par multiplication ou recombinaisons naturelles”. * Le décret 93-774 complète cette définition en spécifiant en son article 1er que sont concernés notamment les O.G.M. obtenus par trois types de techniques : - Les techniques de recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN), visées par la recommandation 82/472/CEE, qui utilisent des systèmes vectoriels. - Les techniques impliquant l'incorporation directe dans un micro- organisme ou un organisme de matériaux héréditaires préparés à l'extérieur du micro- organisme, ou de l'organisme, y compris la micro-injection et la micro-encapsulation. - Les techniques de fusion cellulaire (y compris la fusion de protoplastes) ou d'hybridation dans lesquelles des cellules vivantes présentant de nouvelles combinaisons de matériaux génétiques héréditaires sont constitués par la fusion de deux cellules ou davantage, au moyen de méthodes ne survenant pas naturellement”. Sont en revanche écartés du champ d'application de la loi, les organismes génétiquement modifiés “obtenus par des techniques qui ne sont pas considérées, de par leur caractère naturel, comme entraînant une modification génétique ou par celles qui ont fait l'objet d'une utilisation traditionnelle sans inconvénient avéré pour la santé publique ou l'environnement”. * L'article 2 de la loi complété par l'article 2 du même décret 93-774 excluent donc : Les organismes obtenus par plusieurs techniques telles que : - La fécondation in vitro ; - La conjugaison, la transduction, l'infection virale, la transformation ou tout autre processus naturel ; - L'induction polyploïde à condition qu'elles ne fassent pas appel aux techniques de recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou à des organismes génétiquement modifiés“ * (article 2-I) ; – les organismes obtenus par plusieurs techniques telles que - La mutagenèse; - La formation et l'utilisation d'hybridomes animaux somatiques ; - La fusion cellulaire, y compris la fusion de protoplastes, de cellules provenant de végétaux pouvant être produits par des méthodes de culture ou de multiplication traditionnelles ; - L’auto-clonage de micro-organismes non pathogènes survenant de façon naturelle et répondant aux critères du groupe I pour les micro-organismes récepteurs. - L'infection de cellules vivantes par les virus, viroïdes ou prions à condition qu'elles ne comportent pas l'utilisation d'O.G.M. en tant qu'organismes récepteurs ou parentaux” (article 2-II). * 04/04/18 Design des panneaux ou lettres Une fois que la transformation des bactéries est réussie, la souche bactérienne transformée est régulièrement repiquée stérilement sur agar nutritif. Pour cela, un échantillon est prélevé avec une anse stérile et étalé en stries à la surface du milieu. Les boîtes de Pétri sont ensuite mises à incuber à la température du GL. La bioluminescence adaptée au design du lettrage se fera dans un milieu liquide LB plus ampicilline. La bioluminescence se développe en général au bout de 18 à 24 h et se maintient de deux à quatre jours. En repiquant la souche régulièrement, on dispose en permanence de cultures prêtes à l’emploi car dès que la luminescence des boîtes devient visible, elles sont placées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’emploi. Après sortie du réfrigérateur, les capacités de bioluminescence sont pratiquement inchangées et se manifestent dès le retour à température ambiante. Pour des résultats plus optimales on peut améliorer la technique de bioluminescence en ajoutant un opéron lactose+IPTG afin de transcrire en continu de la luminescence. Résultats à comparer avec la bioluminescence de cette transgenèse. * 10/04/18 Culture en milieu liquide