Camille Gillet/Gauthier Landerer

camillegillet12@gmail.com

landerer.gauthier@gmail.com

début: février 2018

L'objectif de ce projet est de créer un bioréacteur.

I- Qu'est ce qu'un bioréacteur ?

I.1- Description d'un bioréacteur.

Un bioréacteur du plus simple au plus complexe retrouvée en industrie répond à chaque fois au schéma générale suivant:

Un bioréacteur, appelé également fermenteur ou propagateur, est un appareil dans lequel on multiplie des micro-organismes (levures, bactéries, champignons microscopiques, algues, cellules animales et végétales) pour la production de biomasse (écologie), ou pour la production d'un métabolite ou encore la bioconversion d'une molécule d'intérêt. Contrairement aux systèmes plus simples utilisés pour faire pousser des micro-organismes, comme les fioles, le bioréacteur permet de contrôler les conditions de culture (température, pH, aération, etc.), et de ce fait, il permet de récolter des informations de plus grande fiabilité.

I.2- Composition d'un bioréacteur.

Un bioréacteur comporte :

• Une cuve ou enceinte en verre
• Un bouchon si nécessaire pour ne pas laisser passer l'air du milieu intérieur et celui du milieu extérieur
• Une seringue avec cathéter pour injecter une solution
• Un système d'agitation comportant une ou plusieurs turbines selon leur taille, ou simplement un bulleur d'aquarium
• Des capteurs pour la mesure de la température (thermomètre), du pH (pH-mètre), de la concentration en oxygène dissous (sonde oxymétrique), du niveau…
• Un système de contrôle-commande géré par ordinateur permettant d'enregistrer et piloter tous les paramètres de fonctionnement

Les bioréacteurs permettent la fabrication de nombreux produits :

• bière, yaourts, additifs alimentaires
• vaccins, antibiotiques, anticorps, vitamines, acides aminés

I.3- Exemples d'utilisation d'un bioréacteur pour divers procédés.

Il existe différents types de bioréacteurs qui ont des applications variées:

• Le fermenteur à bières

• Le fermenteur à spiruline

• * * Le bioréacteur pour cultures cellulaires * Le fermenteur à kéfir * Le fermenteur à Kombucha I.4- Pourquoi un bioréacteur au GreenLab <note tip> Au GreenLab, nous avons un système d'aquaponie et 2 autres aquariums avec des poissons rouges et des guppys. Nous avons pour projet d'utiliser notre bioréacteur afin de fabriquer de la spiruline. Cette spiruline serait utilisée pour nourrir des crevettes, elles-mêmes utilisées pour nourrir nos poissons. </note> Avant d'expliquer notre démarche que nous avons suivi pour réaliser notre bioréacteur, nous allons déjà nous intéresser plus en détail à la spiruline. —- II- Qu'est ce que la spiruline ? Noms communs : spiruline, algue bleu-vert, cyanobactérie. Noms botaniques : Arthrospira platensis, Spirulina platensis, Spirulina maxima, Spirulina pacifica, famille des cyanobactéries. Nom anglais : spirulina. II.1- Description de la spiruline. La spiruline est une algue qui existe telle quelle depuis plus de 3 milliards d'années. Ainsi nommée en raison de sa forme spiralée, elle appartient à la famille des cyanobactéries ou microalgues bleu-vert. Il existe près de 1 500 espèces d'algues bleues, et 36 espèces de spiruline sont comestibles. La principale espèce actuellement offerte sur le marché est la Spirulina platensis. D’abord cultivée principalement en Californie et à Hawaï, la spiruline est maintenant produite de façon contrôlée partout dans le monde où le climat le permet : Chili, Chine, Cuba, Inde, Afrique de l’Ouest, Grèce (en serres géothermiques), etc. Dans le commerce, la spiruline se présente généralement sous la forme d'une poudre bleu-vert déshydratée, en vrac ou en capsules. II.2- Composition nutritionnelle de la spiruline. La spiruline, faible en calories, contient une mine de nutriments dans un très petit volume (liste partielle ci-dessous). Sa teneur peut cependant varier selon son origine géographique, mais aussi selon les procédés de culture, de séchage et de broyage. La spiruline contient de 55 % à 70 % de protéines d'excellente qualité (proportion des acides aminés et digestibilité optimales), soit de 2,5 g à 3,5 g de protéines par 5 g de poudre. La spiruline est une source exceptionnelle de caroténoïdes variés (bêta-carotène principalement, mais aussi cryptoxanthine, lutéine, zéaxanthine, etc.), soit autour de 22 mg/5 g. Elle fournit notamment une quantité astronomique de bêta-carotène, soit de 12 000 UI à 25 000 UI par 5 g de poudre. Elle constitue une excellente source de fer, soit de 3 mg à 8 mg par 5 g. Elle contient une quantité appréciable d'acide gamma-linolénique (de 40 mg à 50 mg/5 g), un acide gras insaturé de la famille des oméga-61. Pour en savoir plus sur les oméga-6, consulter notre fiche Acides gras essentiels. De plus, la spiruline est riche en phycocyanine, le seul pigment bleu naturel pouvant servir de colorant alimentaire et auquel on attribue une activité antioxydante importante. Elle contient également de la chlorophylle et de petites quantités de plusieurs minéraux. Voilà pourquoi on parle souvent de cette algue comme d’un « superaliment ». II.3- Conditions nécessaire à la culture de la spiruline. II.3.1- L'eau La Spiruline pousse grâce à l’utilisation d’eau et d’engrais. Grâce à son haut niveau de pH, ce type de culture ne nécessite pas d’utiliser une eau de très grande qualité : eau potable, saumâtre, de pluie ou provenant d’un corps naturel, tous ces types d’eau peuvent être utilisés. Même de l’eau contaminée peut faire l’affaire, étant donné que les parasites qui y sont présents (germes et virus) ne peuvent pas survivre à l’environnement alcalin de la culture. La seule eau qui ne doit pas être utilisée et celle contenant des métaux lourds, car la Spiruline les absorberait et ne serait plus consommable pour l’homme. II.3.2- Le pH L’environnement dans lequel est cultivé la Spiruline est hautement alcalin, ce qui assure la prédominance de la Spiruline sur les parasites : la majorité d’entre eux ne peuvent pas survivre dans un tel environnement. Le niveau de pH de la culture doit être maintenu entre 10 et 10,5. Cela peut être fait en utilisant du matériel de laboratoire mais le moyen le plus simple et le moins cher de contrôler le niveau de pH est d’utiliser du papier pH : en trempant pendant quelques secondes ce papier dans l’eau, la couleur qu’il prend vous indique le niveau de pH de votre culture. Il suffit alors de comparer la couleur de votre papier tournesol avec le nuancier de couleurs sur la boîte fournie avec le papier pour déterminer le niveau de pH. Le papier pH se trouve dans les laboratoires. II.3.3- Le milieu de culture. L’environnement dans lequel la Spiruline pousse se compose d’eau et d'espèces chimiques. Le milieu de culture se compose des éléments suivants: * Bicarbonate de soude (NaHCO3) * Nitrate de Potassium (KNO3) – Vous pouvez le remplacez (comme nous allons le faire) par de l'urée * Chlorure de Sodium (NaCI) – Vous pouvez prendre du sel de table. * Dihydrogénophosphate de potassium monopotassique (KH2PO4) – peut être remplacé par tous types de phosphates utilisés dans l’agriculture (Phosphate de Monoammonium ou Phosphate Diammonium) * Sulfate ferreux (FeSO4) * Sulfate de Magnesium (MgSO4) * phosphate mono-ammonique (NH4H2PO4) —- III- Le bioréacteur du GreenLab. III.1- Matériel Pour la réalisation de notre premier prototype, nous avons besoin de: * 2 bandes de Led (d'environ 80cm chaque) * 1 résistance * 1 bulleur d'aquarium * 1 tube de plexiglas de 4L (environ 84cm de hauteur) * 1 robinet * 1 caisson en bois * 2 ronds de plexiglas pour fermer le tube III.2- Protocole et montage du bioréacteur. Le bioréacteur devra être stérilisé à la vapeur à 121° pendant 20 minutes (stérilisation in situ). Il faut veiller au maintien de cette stérilité lors de la mise en place de la culture pour éviter d’éventuelles contaminations par des bactéries. Une source lumineuse permettant la catalyse de la réaction sera placée derrière les poches. Les micro-organismes vont absorber la lumière via les pigments photosynthétiques. Il faudra aussi placer une résistance derrière les poches pour permettre la production de chaleur, nécessaire à la culture. On réalisera un système d’agitation dans le bioréacteur pour éviter un brassage insuffisant des cellules et du milieu de réaction de façon à éviter l’apparition de gradients de concentration et ainsi permettre une croissance homogène. Le système d’agitation sera réalisé par injection de gaz à l’aide d’une pompe à air. On pourra rajouter des capteurs pour contrôler la température, le pH et la concentration d’oxygène dans la poche. Pour placer ces capteurs, il faudra réaliser des trous dans la poche et fabriquer un embout à placer sur la poche afin que le système reste hermétique. Pour injecter de l'eau ou éventuellement un inoculum, si nécéssaire, on pourra réaliser des trous dans le tube sur lesquels on mettra des embouts pour garder le système hermétique. On pourra relier des tuyaux en plastique avec des seringues à ces trous. Enfin, le tube pourra posséder un robinet pour que l'on puisse extraire le produit de la réaction. Le milieu de réaction, préparé en amont et mélangé à l'eau, sera placé dans le tube qui sera ensuite fermée hermétiquement. Pour lancer la réaction, il faudra allumer la source lumineuse, la pompe à air, la source de chaleur et les éventuels capteurs. Le prototype sera réalisé selon le modèle utilisé par Artilect (FabLab de Toulouse au Festilab de 2017). Nous allons, dans un premier temps, réaliser un essais dans un tube de 4L suivant le modèle ci-après. Pour ce premier essai, nous utiliserons le même protocole que celui utilisé pour les poches de 10L. Pour le milieu de culture, il faut: * 16g/L de bicarbonate de sodium → 64g * 1g/L de sel marin → 4g * 2g/L d'urée → 8g * 0.1g/L de sulfate dipotassique → 0.4g * 0.1g/L de phosphate mono-ammonique → 0.4g * 0.1g/L de sulfate de magnésium → 0.4g * 0.1g/L de sulfate de fer ferol ps → 0.4g Pendant la culture, il y a certains paramètres à surveiller: * la concentration * le pH (il doit être compris entre 8.0 et 11) * la hauteur d'eau * le sel La culture doit se faire à au moins 20°C. Pour une vitesse de croissance maximale, la culture doit se faire à 35-37°C. Il faut cependant veiller à ce que la température ne dépasse pas les 40°C, pour éviter la destruction de la culture. Au début de la culture, le pH de la culture sera compris entre 8 et 8.5. Si le pH est trop bas, on rajoutera du bicarbonate de soude. Si la culture est peu concentrée, il faut diminuer l'exposition à la lumière pour éviter la photolyse. Si la culture est épaisse et présente une couleur plus claire que la normale (vert-bleu profond et sombre), il faut diminuer l'exposition à la lumière et diminuer l'apport en nutriments (dans un cas extrême, on peut rajouter de l'eau dans la culture). Si les spirulines se rassemblent en grumeaux au fond du bassin, il faut diminuer l'apport en lumière, agiter pour défaire les grumeaux et ajouter de l'azote dans le milieu. Si la culture est gélatineuse au toucher, cela signifie qu'il y a un manque d'azote et/ou de soufre dans le milieu: il faut donc ajouter de l'urée en faible quantité dans le milieu. Enfin, si de l'écume se forme, il faut diminuer l'exposition à la lumière. Pour vérifier la concentration de la culture, on mesurera le pH à l'aide de papier pH. En bonnes conditions, la quantité de spiruline double dans la culture tout les 2 à 4 jours, jusqu'à atteindre une concentration maximum. Le bouchon, placé sur le rond de plexiglas qui fermera notre tube de culture, permettra l'ajout de nutriments si besoin, mais aussi le renouvellement du milieu de culture après récolte. Les ajouts de petites quantités pourront être réalisés à l'aide d'une seringue. Quant aux ajouts de grandes quantités (renouvellement du milieu après récolte), ils pourront être réalisés directement à l'aide d'un entonnoir dans le trou prévu à cet effet. Nous allons construire un caisson en bois afin de maintenir la structure (tube en plexiglas + matériel nécessaire à la culture). Ce caisson sera composé de 5 couches de bois de 22mm d'épaisseur chacune. Nous usinerons ces planches à l'aide d'une fraiseuse numérique. Nous aurons, au préalable, modélisé nos plans en 3D à l'aide du logiciel Fusion 360. Grâce à ce logiciel, nous allons créer des espaces réservés pour placer notre tube et notre bulleur d'aquarium. Nous créerons aussi des traces afin de faire passer les câbles nécessaire au fonctionnement du bulleur, des LED et de la résistance. Les couches seront ensuite superposées les unes au autres et fixées à l'aide de colle. Nous suivrons les plans suivants. Pour fermer la partie antérieure de notre tube en plexiglas, nous fixerons un rond de plexiglas à l'aide d'une colle. Puis, nous vérifierons l'étanchéité de la structure. Nous ajouterons, si besoin, 2 couches de joint. Le rond de plexiglas sera percé de manière à laisser passer le câble de la résistance et l'arrivée d'air par le bulleur (si besoin, nous ajouterons quelques vis pour veiller au maintien de la structure). Afin de maintenir l'étanchéité de notre structure, nous ajouterons de la colle au niveau de ce trou et 2 couches de joint (1 extérieure et 1 intérieure). Le rond de plexiglas, préalablement fixé à une planche en bois pour éviter qu'il ne se casse, sera percé à l'aide d'une scie à cloche (foret étagé). La vitesse de la perceuse devra être réglé au minimum pour éviter que le plexiglas ne chauffe et ne fonde. Enfin, il faudra percé lentement afin d'éviter que le plexiglas ne se casse. III.3- Déroulement de la culture. Pour lancer la réaction, nous placerons dans le tube: * 2L d'eau + mélange de nutriments * 2L d'inoculum Il faudra contrôler régulièrement le niveau d'eau et en rajouter si nécessaire pour maintenir un niveau haut d'eau dans le tube. On allumera la source lumineuse, la source de chaleur et le bulleur d'aquarium. On laisse la réaction se faire durant 2 à 4 jours en contrôlant le pH régulièrement. Quand le pH atteint 10-10.5, on peut procéder à la récolte. Après la récolte, il faut filtrer la spiruline avec un tissu: * Le liquide tombe en-dessous * La spiruline reste sur le tissu Il faut essorer au maximum pour éliminer le plus de liquide et ainsi atteindre un pH de 7 pour que la spiruline soit consommable (quand le liquide devient vert, on peut arrêter d'essorer). Il faut ensuite sécher la spiruline obtenue, en l'étalant sur un drap: * 16h à 40 degrés * 4h à 60 degrés * 2 jours au soleil Tableau de bord: suivi du projet. ===26/02 au 12/03=== Réalisation des plans pour le caisson en bois. Début de la modélisation en 3D sur le logiciel Fusion 360. ===16/03=== Nous avons poncé notre tube en plexiglas afin de rendre la structure régulière et ainsi permettre la fixation du rond de plexiglas sur la partie antérieure. ===11/05=== Compte-tenu de notre impossibilité à se fournir en inoculum de spiruline, nous avons décidé de créer un prototype de notre bioréacteur afin de produire du kéfir. Nous avons utilisé des flacons de laboratoire équipés de bouchon percés afin de permettre l'évacuation du gaz produit par la fermentation. Nous avons rempli ces flacons de 125 mL d'eau, environ 20 mL de graines de kéfir (mesuré à l'aide d'une éprouvette graduée) et environ 1/8 d'un tube à essai de sucre blanc. Nous avons placé ces flacons sur un agitateur (puissance 2). La culture devrait être prête en 24h. <note tip> Le protocole initial est le suivant: 1L d'eau, 1 louche de kéfir et 1 louche de sucre roux. Nous avons utilisé du sucre blanc pour notre protocole. Le sucre blanc est plus pauvre en minéraux mais, il donne un autre goût au kéfir produit. ** </note>

La culture des grains de kéfir trouble l'eau. Cela nous indique que la première culture est prête. Nous avons enlevé le liquide de chaque flacon et nous l'avons remplacé dans 125 mL d'eau et de nouveau 1/8 de tube de sucre. Nous avons laissé les grains de kéfir de la première culture dans les flacons. nous avons ainsi lancé la 2ème culture.

La deuxième culture a bien marché. Les grains de kéfir grossissent au fur et à mesure. Nous allons répéter le protocole de changement de milieu toutes les 24/48h.

En vue de continuer notre projet initial, nous avons revu nos plans de fabrication du caisson qui servira à entourer notre tube de plexiglas. Nous usinerons ce caisson dans la semaine à l'aide d'une fraiseuse numérique.

Aujourd'hui, nous avons finalisé les plans du caisson sur fusion 360. Nous les avons exporté au format dxf pour pouvoir les travailler sur le logiciel de la fraiseuse numérique. Nous avons usiné le caisson à la fraiseuse selon les plans suivants.

Les trous de 5mm sur chaque planche nous permette de les aligner à l'aide d'une tige en métal. Nous avons aussi une planche n°7 entière.

Sur les planches 5, 6 et 7 nous avons rajouté un trou après usinage pour tenir la tête de la résistance pour que celle-ci ne bouge pas dans le tube en plexiglas.

Nous avons réalisé un premier montage expérimental de nos pièces en bois pour avoir une idée de l'assemblage à réaliser.

Aujourd'hui, nous avons découper le rond de plexiglas qui servira à fermer notre tube. Nous avons découpé un cercle de 25mm sur ce rond de plexiglas, afin d'avoir un trou pour faire passer la résistance à l'intérieur de notre tube. Nous avons usiné le plexiglas à l'aide d'une découpeuse laser.

Nous avons modélisé en 3D, à l'aide du logiciel Fusion 360, une pièce que nous collerons sur le rond de plexiglas. Cette pièce servira à tenir notre bulleur à l'intérieur du tube. Le bulleur passera dans un trou au centre de la pièce et serra ainsi maintenu.

Aujourd'hui, nous avons imprimé la pièce qui servira à tenir le bulleur et la résistance. Nous l'avons collé sur le rond de plexiglas et nous avons fait passer le bulleur. Nous avons ensuite réalisé des joints tout autour du bulleur et de la pièce pour assurer l'étanchéité de la structure.

Aujourd'hui, nous avons fixé la résistance à la pièce 3D et au rond de plexiglas et nous avons réalisé les joints à l'aide de silicone afin d'assurer l'étanchéité. Ensuite, nous avons collé le rond de plexiglas, avec le matériel fixé, à la partie inférieure de notre tube. Nous allons laissé la structure sécher pendant 24h.

Nous avons posé les joints il y a maintenant 3 jours et ceux-ci ne sont toujours pas secs. Nous allons attendre jusqu'au 18/06 et nous procéderons à un test d'étanchéité. Nous essayons de contacter la base de Roscoff afin de se fournir en inoculum de spiruline.

Nous avons réalisé des tests d'étanchéité mais nous constatons une fuite au niveau de la résistance. Donc nous allons faire un joint à ce niveau pour essayer de régler le problème. De plus le joint que nous avons posé le 12/06 n'est pas encore totalement sec alors que nous l'avons posé il y a 6 jours ce qui est anormal. La base de Roscoff que nous avons contactés ne nous répond pas donc nous n'avons de spiruline pour le moment.

Nous avons réalisé les derniers joints au niveau de la résistance. Nous ferons de nouveau un test d'étanchéité le 21/06. La base de Roscoff nous a répondu mais, la spiruline est hors de nos moyens, nous allons réfléchir à une autre solution.

Aujourd'hui nous avons réalisé un nouveau test d'étanchéité. Il reste une petite fuite au niveau du fil de la résistance. Nous avons donc mis de la colle cyano à ce niveau et, après séchage, nous avons fait un joint en plus.

Le joint réalisé vendredi 22/06 est sec et a colmaté la fuite. Cependant, ceux réalisés au niveau de la molette de la résistance ne sont toujours pas secs et on constate une fuite à ce niveau. Le silicone utilisé pour les 2 joints n'est pas le même. Nous avons donc retiré celui non sec au niveau de la molette et nous en avons fait un nouveau avec le silicone utilisé le 22/06 au niveau du fil.

Voici les liens des différents sites qui nous ont permis de réaliser notre projet:

https://fr.wikipedia.org/wiki/Bior%C3%A9acteur

https://www.artilect.fr/bio-fablab-projet-023/

http://sti.epfl.ch/page-102217-fr.html

http://www.bierealamain.fr/18/05/2015/brassage-diy-fabriquer-votre-fermenteur-vous-meme/

http://univers-biere.net/materiel.php

https://www.lambda-instruments.com/fr/fermenteur-bioreacteur/#video

https://fr.scribd.com/document/288339460/Comment-Fabriqu-Comment-fabriquer-son-propre-fermenteurer-Son-Propre-Fermenteur-Www-synbiovie-fr

http://www.instructables.com/id/Farma-an-at-home-bioreactor-for-pharmaceutical-dru/

http://www.solidariteetprogres.org/IMG/pdf/photobioreacteur.pdf

http://spirulinenaquarium.blogspot.fr/p/ensemencement-et-entretien.html

http://www.aquaponiefrance.com/guides/produire-de-la-spiruline.html

http://justspirulina.org/manuel-spiruline-by-maya-savir-justspirulina/

http://francesurvivalistes.fr-bb.com/t1554-culture-des-grains-de-kefir-et-boisson#