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Porteur du projet: Anabely Gutierrez — anabely

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Qu'est ce que c'est la Bioluminescence ?

La bioluminescence est un phénomène observé dans des milliers d’espèces d’organismes vivants tels que bactéries, protozoaires, champignons, annélides, cnidaires, mollusques, insectes et poissons. Le rôle de la bioluminescence varie suivant ces organismes. On note quatre fonctions principales :

1. l’éclairage
2. l’appât
3. la protection
4. la communication

Les organismes font de la fluorescence grâce à une protéine substrat (la luciférine) et la luciférase (enzyme biocatalyseur), lorsque c'est deux protéines se rencontrent, elles s'associent en un complexe qui catalyse la réaction d'oxydation de la luciférine(soit une perte d'électrons dans sa couche de valence) par le dioxygène.Cette oxydation fait passer la luciférine d'un état stable à un état excité et instable. La molécule retourne nouvellement à son état stable et émet un photon qui produit une lumière dans les spectres du bleu et du vert. Le complexe luciférine-luciférase se déssemble en générant une molécule de CO2. Les deux protéines sont alors disponibles pour un nouveau cycle de réaction. La lumière produite peut ensuite être réfléchie ou amplifiée par d’autres structures organiques. Ce processus a besoin d'énergie sous forme de six ATP pour chaque photon émis.

Fig. 1 La luciférase catalyse la réaction de bioluminescence en oxydant la luciférine en oxyluciférine en présence d’oxygène, d’ATP et de Mg2+. Ceci provoque alors l'émission d'un photon dont la lumière résultante est jaune-verte. Lors de cette réaction, l'ATP est hydrolysée en AMP. De plus, il est crucial que le substrat ait la bonne chiralité : D(-) Luciférine pour que la réaction ait lieu. L'oxydation du substrat dans la réaction par l'enzyme luciférase (gène Lux) entraînant une émission d'énergie sous la forme de lumière.

<note> Ce phénomène est historique!

La bioluminescence est connu depuis l’antiquité. Aristote (348-322 av JC) parlait déjà de lumière émise par des poissons morts et des moisissures. A partir de 1600 diverses recherches permirent d’établir que cette réaction mettait en jeu une enzyme (la luciférase), un substrat oxydable (la luciférine) ainsi que l’oxygène. Les enzymes et substrats utilisés pour les réactions de bioluminescence sont extrêmement variés d’un organisme à l’ autre.

</note>

Chez les bactéries, la luciférase catalyse l’oxydation de la riboflavine mononucléotide réduite (FMNH2) et une longue chaîne d’aldéhyde (R-CHO), générant une flavine oxydée (FMN), un acide gras (R-COOH), de l’eau (H2O) et de la lumière (490-500 nm).

<note tip> R-CHO + FMNH2 + O2 –[LUCIFERASE] →FMN + R-COOH + H2O + LUMIERE à ~500 nm </note>

Fig 2. Modèle en 3D de la GFP, elle est constitué de 238 acides aminés et a un poids de 27KDa.

Objectif

L’objectif c'est d'étudier la réaction décrite ci-dessus dans des bactéries E. Coli souche DH5-alpha. Ce sont de Bactéries induites de localisation spécifique grâce à une construction plasmidique du gène Lux117 contenant la Green Fluorescent Protein , cette protéine est intrinsèque et est souvent fusionné in vitro.

Principe

• Le principe réside en transformer les bactéries d'Escherichia coli. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement

au CaCl2.

• L’ADN aussitôt ajouté se fixe sur les bactéries.
• Ensuite elles sont gardées sur glace ce qui fige les membranes.
• Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 30 minutes afin de

permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé (AmpR).

• Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN).

<note>L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques ou encore de rendre les bactéries virulentes.</note>

Plasmide p-lux 117, pVH-luxO

Pour cette expérience nous allons utiliser le plasmide lux117. Celui-ci contient une origine de réplication (ori), un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline (ampR) ainsi que l’opéron lux, (un opéron est une unité de transcription) provenant de la bactérie Vibrio harveyi. Cet opéron contient 5 gènes, luxA à luxE. Ils codent pour les protéines impliquées dans la réaction de bioluminescence. Le gène ampR code pour une enzyme (la ß-lactamase) capable d’inactiver les antibiotiques de la famille des pénicillines en clivant une liaison du noyau ß-lactame. Seules les bactéries possédant le gène ampR sont capables de croître sur un milieu contenant de l’ampicilline (antibiotique). Les colonies seront alors blanches et fluorescents dans l'obscurité.

Fig. 2 Carte de restriction de Lux117. L'opéron de Lux code pour la luciférase bactérienne ( luxAB ) et le complexe d'acide gras reductase ( luxCDE ) qui est responsable de la biosynthèse pour la réaction luminescente.

<note>Les mutations qui possède la souche DH5-Alpha sont : dlacZ DELTA M15 DELTA (lacZYA-argF) (Permet le criblage bleu des cellules recombinantes) U169 recA1 (réduit la combinaison homologue par un insert plus stable) endA1(permet une dégradation de l'endonucléase inférieure qui assure le taux de tranfert de plasmides plus élevés) hsdR17 (rK-mK +) supE44 thi-1 gyrA96 rel A1. La structure génomique de cette souche est un chromosome circulaire singulier composé de 4 638 137 nucléotides, 4359 gènes et 4128 gènes codant pour des protéines </note>

Expérience

Préparation des cellules compétentes: 

La première procédure c'est de rendre les bactéries compétentes (c'est à dire que l'on s'assure que son état physiologique garantira une efficacité maximum de transformation et ensuite on procédera à les transformer (insertion d'ADN de la GFP).

<note important>Attention ! : Toutes les manipulations de type microbiologique se feront stérilement, inclus le matériel.</note>

1. Prendre une culture d’une nuit de bactéries Escherichia coli (DH5a). Diluer cette culture 1/100 fois dans 40 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 250 ml. Agiter

vigoureusement à 37°C .

<note important>Attention : à partir de ce moment, la culture et le matériel à manipuler doit être froid sous la glace (~4°C)</note>

1. Après environ 3 heures, vérifier la densité optique de la culture. Quand la densité optique (DO600) est entre 0.5 et 0.6, mettre l'Erlenmeyer contenant les

bactéries dans la glace.

1. Prélever 1.5 ml de culture et les transférer dans 1 tube Eppendorf 1.5 ml. Marquer ce tube avec un +. Prélever 1.5 ml dans un autre tube Eppendorf. Marquer ce tube avec un -. L’ADN sera mis dans le tube marqué +. Le tube marqué - servira de contrôle.
2. Centrifuger les tubes Eppendorf  30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules.
3. Jeter le surnageant.
4. Ajouter 1 ml de CaCl2 0.05M froid sur le culot et le resuspendre doucement en utilisant la pipette P1000.

<note important>Attention, il faut pipeter doucement et éviter d'aspirer les cellules dans la pipette elle-même.</note>

1. Centrifuger les tubes comme avant. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100 µl de CaCl2 0.05M froid.
2. Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l'emploi (“compétentes” pour la transformation).

<note>Il est important que les solutions et les tubes soient gardés sur glace.Les cellules refroidies sont mises en contact d'une solution concentrée de chlorure de calcium. Le calcium chélate les phospholipides des membranes et participe à la rigidification des membranes à froid. De plus le calcium neutralise l'ADN transformant et lui permet de sédimenter au contact de la membrane avant son insertion dans la bactérie.</note>

La transformation:

• Ajouter 8 µl d’ADN (plasmide LUX117) dans le tube marqué +.

<note warning>Précautions pour garder l’ADN plasmidique intact 1-mettre des gants pour ouvrir le tube (protection contre les nucléases) 2-Le refermer immédiatement après emploi 3-Conserver constamment ce tube sur la glace surtout lors du passage d’un poste de travail à l’autre 4-Ne pas chauffer le tube dans la main ; ne pas le mettre près de la flamme 5-Ne pas le renverser</note>

• Mettre le tube marqué + et le tube marqué - sur la glace pendant 15 minutes.
• Incuber les tubes deux minutes à 42°C (choc thermique) ou 90 secondes en bain marie à 42°C

<note>Les membranes rigidifiées par la température basse et stabilisées par le CaCl2 vont s'ouvrir brièvement lors d'un choc thermique à 42 °C, et laisser passer l'ADN transformant. Les membranes se refermeront dès le choc thermique passé. Ce procédé est très destructeur et peu de bactéries y survivent, d'autre part peu de bactéries auront intégré un fragment d'ADN. La mortalité des cellules est très importante lors du choc thermique </note>

• Replacer les tubes dans la glace pendant 5 minutes.
• Ajouter 1 ml de LB (milieu nutritif) et incuber la suspension à 37°C pendant 30 minutes (pour l'expression de la résistance à l'ampicilline).

Déposer et étaler:

1. 0.1 ml du tube + sur une boîte LA + Amp
2. 0.1 ml du tube + sur une boîte LA
3. 0.1 ml du tube – sur une boîte LA+ Amp
4. 0.1 ml du tube – sur une boîte LA

• Centrifuger le reste de la suspension 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules.
• Enlever 0.7 ml de surnageant et le jeter.
• Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant
• Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une boite LA + Amp.
• Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h.
• Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et incubées la nuit à 37°C juste avant de les observer.

Résultats:

Conclusions:

Applications :

La bioluminescence peut-être utilisée également comme indicateur de l'activité métabolique cellulaire et ainsi surveiller l'activité biologique et la toxicité des polluants, dans les projets de biorémediation. Pour quantifier l'activité métabolique on utilise la réaction de bioluminescence où il intervient 6 ATP pour chaque photon émis. L'ATP, est un indicateur de réactions biochimiques au sein d'un organisme vivant. Plus il y a de l'ATP et plus les organismes fonctionnent correctement et moins il y a “propagation” de toxicité dans les cellules au cours du temps. l' l’ATP c'est donc le réactif limitant dans toutes les expériences de ce type de dosage.

Références :

• Wu, N., Rathnayaka, T. et Kuroda, Y. (2015). Expression bactérienne et ré-ingénierie de la luciférase de Gaussia princeps et son utilisation en tant que protéine rapporteur. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protéines et Protéomique, 1392-1399.
• Nunes-Halldorson, V. da S. et Duran, NL (2003). Bactéries bioluminescentes: gènes lux en tant que biocapteurs environnementaux. Journal brésilien de microbiologie, No. 34.
• Wiles, S., Ferguson, K., Stefanidou, M., Young, DB et Robertson, BD (2005). Luciferase alternative pour surveiller les cellules bactériennes dans des conditions défavorables. Applied and Environmental Microbiology 71, 3427-3432.
• GST Fusion System Handbook. Edition AA. Ed: Amersham Biosciences, 2002.
• Construction of a stable GFP-tagged Vibrio harveyi strain for bacterial dynamics analysis of abalone infection. Marie-Agnes Travers ;Annaıck Barbou ; Nelly Le Goıc ; Sylvain Huchette ; Christine Paillard ; Marcel Koken. Laboratoire des sciences de l’Environnement MARin, CNRS UMR 6539, Institut Universitaire Européen de la Mer, Université de Bretagne Occidentale, Plouzané , France. 14/10/2008.
• Outils en Biologie. Beguin Claude, Brawand, Favet, Lombard F. Golshmidt M. Rossier C.Roux L. Scherly D. Schnieper L. Département de Biochimie, Faculté des Sciences, UniGe. link: https://www.bioutils.ch/
• Institut Français de l'éducation. site BIOTIC. La transgenèse link : http://acces.ens-lyon.fr/biotic/biomol/transgen/html/prepbac.htm
• DH5-Alpha E.coli. link: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki
• Protopedia Life 3D. 4 juillet 2017, page consulté 7734 fois. link: http://proteopedia.org/wiki/index.php/Luciferase
• Brenda; The Comprehensive Enzyme Information System. Janvier 2018. link : http://www.brenda-enzymes.org/taxonomy.php?f[id][value]=669

Journal et suivi de l'expérience: