FablabSU

Protocole Western Blot :

	Plantes protéines P5CS
1 ) Extraction des Protéines
* Tampon d’extraction	TrisHCl pH 6,8 100mM, 2mL de Glycérol 100%, 2mL de SDS 20% et complété en quantité suffisante pour 10mL avec de l’eau distillée
2) Gels et migrations
* Resolving 8%	3,05mL d’eau, 650µL d’acrylamide, 1,25mL de tris-HCL 0,5M, 50µL de SDS 10%, 25µL d’APS 10% et 10µL de TEMED
* Stacking 4%	4,7mL d’eau, 2,7mL d’acrylamide, 2,5mL de tris-HCl 1,5M, 100µL de SDS 10%, 50µL d’APS 10% et 12,5µL de TEMED
3) Tampon et transfert
* Tampon de transfert BSN	5,82g de tris base, 2,93g Glycine, 200mL d’éthanol absolu, 3,75mL de SDS 10% et complété en quantité suffisante pour 1L avec de l’eau distillée
* Sandwich de transfert horizontal	Nitrocellulose + papier Wattman
4) Blocage
* tampon de blocage	T1+tween BSA : 0,05M de TrisHCl, 2,5% de NaCl(w/v), 0,1% de BSA et 0,05% de Tween-20 pH 7,4
* rinçages	2 rapides + 4 de 10min au T1+tween
5) Incubation
* anticorps primaire	dilué au 1/1000
* rinçages	2 rapides + 4 de 10min au T1+tween
* anticorps secondaire	couplé à une peroxydase dilué au 1/8000
* rinçages	2 rapides + 3 de 10min au T1+tween + 1 de 20min au T1
6) Révélation