Réalisation d'un protocole HPLC

Principe

La chromatographie est un procédé qui permet de déterminer les différents composant d'un mélange. Il existe la chromatographie sur couche mince (CCM) qui est assez connu et appliqué au collège / lycée : en trempant une plaque de CCM, sur laquelle il y a une touche de notre mélange, dans un éluant. L'éluant remonte la plaque en emportant avec lui le mélange. Lorsque le front de l'éluant arrive presque au bout de la plaque, on la retire de l'éluant. On remarque que chaque espèce arrive plus ou moins haut, et on peut ainsi comparer le mélanger à des corps purs connues.

Photos trouvées sur : Interpréter un CHROMATOGRAMME - Chromatographie sur couche mince (CCM) de Maths Physique EASY et Kit d'expérimentation, principes de la chromatographie sur couche mince d'EDVOTEK 

Ce qu'il y a à retenir, c'est que les éléments chimiques circulent plus ou moins rapidement dans un éluant en fonction de leur affinité avec celui ci. Pour l'HPLC, le mélange circule à travers "l'éluant" (qui est sous forme de colonne), à la sortie duquel se trouve un spectrographe. Ses composants traverseront la colonne plus ou moins rapidement, le spectrographe en sortie affichera alors les spectres d'absorption de "chaque" espèce du mélange.

Photo prise de la machine au fablab

La méthode HPLC permet une double vérification des composant, et l'aspect numérique est plus précis qu'une simple CCM. De plus, la spectrographie permet de déterminer la concentration de chaque élément.

Explication

Pour se familiariser avec l'utilisation de la machine à HPLC (chromatographie en phase liquide haute performance ou haute pression) de l'entreprise Beckmann Coulter avec une colonne C18 (ou phase inverse, revert phase, RP), on essaie de retranscrire un protocole simple, reposant sur le matériel que nous avons.

Nos conditions sont les suivantes : 

• le protocole doit être simple
• la phase mobile doit être soit de l'eau soit de l'acétronitrile
• la colonne doit mesurer 250 mm * 4.60 mm (c'est la colonne que nous avons au fablab)

Le protocole choisi permet de déterminer la concentration en caféine dans les suppléments alimentaires pour perdre du poids.

Réactifs :

• Caféine comme réferenceférence standard
• Acétonitrile
  
• Eau ultra pure;pure
  
• Échantillons tests–tests – supplément alimentaire à base de caféine.ine
  

Matériels :

• Varian Pro Star HPLC system, system
  
• déDétecteur UV
  
• colonneColonne C18,   4.6 mm
  
• thermostat,Thermostat
  

• bainBain à ultrason 
  
• seringueSeringue HamiltonHamilton conçue pour injection manuelle dans les ports HPLC (25mcl).
  25 ml)

ConditionsConditions expérimentalesde :chromatographie

La
• Phase chromatographiemobile s'effectue en phase mobile
  avec 65% d'eau et 35% acétonitrile et les paramètres suivants : 
  
  • Détection UV : 274 nm, nm
    
  • Débit : 1 ml/min, min
    
  • Colonne : C18,C18
    
  •  TempéTempérature thermostat : 25°C.C
    

  Préparation des solutions standards :

  
  

  Dilution dans une solution d’acétonitrile/eau en ultrasonication pendant 15 min dans un bain à ultrason. 

  Préparation des échantillons teststests
  

  :
  

  1.

  1. Extraction avec de l'acétonitrile/eau, une ultrasonication dans un bain à ultrasons pendant 15 minutes.

  2. Filtration deux fois pour toutes les solutions: 

      - Préfiltration pour éliminer les grosses particules des solutions.

      - Filtration plus fine avec des filtres à seringue (taille des pores 0,45 μm). 

  3. Analyse de tous les échantillons en triplicata.

  2. Peser la capsule pour avoir son poids exacte
     exacte.

     Réduire la capsule alimentaire à analyser sous forme de poudre.

     Dans un bécher de 50 ml, dissoudre la poudre obtenue dans la phase mobile acétonitrile:eau 35:65

     Filtrer65Filtrer sous Buchner.

     Récupérer le filtrat et le diluer dans la phase mobile en proportion 100/200

     200.

     Injecter 20 mclml de la solution dans l'appareil HPLC à l'aide d'une seringue Hamilton de 25 mclml

  3. Filtration deux fois pour toutes les solutions et préfiltration pour éliminer les grosses particules des solutions. Filtration plus fine avec des filtres à seringue (taille des pores 0,45 μm).
  4. Analyse de tous les échantillons trois fois.

   

  Résultats

  Les résultats présentés ci-dessous sont ceux de l'étude :

Sources

Quelles sont les différentes phases en Chromatographie? AirLiquide

Chromatographie en phase liquide à haute performance, Wikipédia

L'article utilisé est celui de Stanislava Ivanova, Kalin Ivanov, Melissa Bekyar et de Pavlina Kostova, publié en mai 2020, intitulé HPLC Method for Determination of Caffeine in Food Supplements for Weight Loss, sur le site ResearchGate.