Sequençage

Cette vidéo vous accompagne petit à petit : https://www.youtube.com/watch?v=JA6mofeuntk

Introduction

Pour exécuter une analyse de séquençage sur le système MiSeq, suivez les étapes de configuration décrites dans ce chapitre.
Il y a trois modes de configuration d’analyse :
--> Local Run Manager : sélectionnez une analyse préparée par Local Run Manager.
--> Sample Sheet (Feuille d’échantillons) : créez une analyse à l’aide de feuilles d’échantillons. Les feuilles d’échantillons sont validées dans Local Run Manager.
--> Manual (Manuel) : créez une analyse en entrant manuellement jusqu’à 10 cycles pour chaque lecture. Aucune analyse secondaire n’est effectuée lorsque l’on choisit ce mode.

- Après le lancement de l’analyse, aucune intervention supplémentaire de l’utilisateur n’est requise.
- Surveillez l’analyse de séquençage à l’aide d’un des éléments suivants :

-->Sur l’instrument, à l’aide de l’écran Sequencing (Séquençage).

-->À distance, à l’aide du visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Cette application facultative est disponible en téléchargement sur le site Web d’Illumina.
--> À distance, à l’aide de Local Run Manager.
Une fois l’analyse de séquençage terminée, effectuez un lavage de l’instrument.

Durée de lʼanalyse

La durée de l’analyse dépend du nombre de cycles réalisés. Vous pouvez réaliser une analyse à lectures appariées comprenant jusqu’à 2 x 301 cycles de séquençage plus des lectures d’index avec MCS v2.3 ou les versions ultérieures.
En outre, la durée de l’analyse est fonction de la version des réactifs MiSeq utilisés et des mises à niveau améliorant les performances effectuées sur votre instrument.

Nombre de cycles d’une lecture

Au cours d’une analyse de séquençage, une lecture comprend un cycle de plus que le nombre de cycles analysés. Le cycle supplémentaire est requis pour les calculs de mise en phase et en préphase.
Par exemple, une analyse de 300 cycles à lecture appariée effectue deux lectures de 301 cycles (2 × 301), pour un total de 602 cycles. À la fin de lʼanalyse, 2 × 300 cycles sont analysés

Séquençage

Une fois les amplifiats générés, ils sont imagés à l’aide de combinaisons de DEL et de filtres propres à chacun des quatre didésoxyribonucléotides à marqueur fluorescent. Une fois l’imagerie d’une plaque terminée, la Flow Cell est déplacée de manière à exposer la plaque suivante. Ce processus se répète pour chaque cycle de séquençage. Après l’analyse des images, le logiciel définit les bases, les filtre et leur attribue un score de qualité.

Analyse

Une fois l’analyse terminée, en mode Local Run Manager ou Sample Sheet (Feuille d’échantillons), le logiciel d’analyse Local Run Manager est lancé automatiquement pour effectuer l’analyse secondaire, qui comprend l’alignement et l’appel des variants. Vous pouvez surveiller l’analyse secondaire depuis un autre ordinateur si vous disposez d’une connexion Internet.

Décongélation de la cartouche de réactifs

Vous pouvez également décongeler les réactifs pendant la nuit dans un lieu de stockage réfrigéré à une
température maintenue entre 2 et 8 °C. Les réactifs conservent leur stabilité durant une semaine lorsqu’ils
sont conservés à cette température.

1-Retirez la cartouche de réactifs de son lieu de stockage maintenu entre -25 et -15 °C.
2 Placez la cartouche de réactifs dans un bain d’eau contenant assez d’eau désionisée à température ambiante pour immerger la base de la cartouche de réactifs. L’eau ne doit pas dépasser la ligne limite d’eau imprimée sur la cartouche de réactifs.

3 Laissez la cartouche décongeler dans ce bain d’eau à température ambiante jusqu’à décongélation complète.
-->Cartouches MiSeq v3 : environ 60 à 90 minutes.
-->Cartouches MiSeq v2 : environ 60 minutes.
4 Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche.

Inspection de la cartouche de réactifs

1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez que toutes les positions sont décongelées.
2 Inspectez les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vous assurer quʼils sont complètement mélangés et quʼils ne contiennent pas de précipités.
3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour éliminer les bulles d’air dans les réactifs.

Comme les tubes des dispositifs d’aspiration MiSeq descendent au fond de chaque réservoir pour
aspirer les réactifs, il est important qu’il ne reste aucune bulle d’air dans les réservoirs.

4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace jusqu’à six heures ou réservez-la à une température comprise entre 2 °C et 8 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez l’analyse.

Chargement des librairies d’échantillons

Lorsque la cartouche de réactifs est complètement décongelée et prête à l’emploi, chargez les librairies préparées sur la cartouche.

1. Nettoyez l’opercule en aluminium couvrant le réservoir Load Samples (Charger les échantillons) à l’aide d’un chiffon de laboratoire peu pelucheux.
2. Perforez l’opercule en aluminium à l’aide d’une pipette propre de 1 ml.
3.  À l’aide de la pipette, transférez 600 µl de librairies préparées dans le réservoir Load Samples (Charger les échantillons). Évitez tout contact avec l’opercule en aluminium.
4. Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface du logiciel de commande de l’instrument MiSeq (MCS).