L'effet d'un polluant (bouillie bordelaise) sur Physarum polycephalum (blob).

( contacts : Rafael.Huertas@etu.sorbonne-universite.fr ; clement.beouch.1@etu.sorbonne-universite.fr ; Lucie.Mazzola@etu.sorbonne-universite.fr ; mona.grelet@etu.sorbonne-universite .fr ) 

 

     Dans le cadre de l'UE LU3SV564 intitulée "Démarche scientifique et application à l'écologie" nous avons comme projet d'étudier le blob, Physarum policephalumpolycephalum, et notamment de voir la réaction et les effets qu'ont les polluantpolluants sur lui. Sur cette page vous allez trouver des guides sur la maintenance de cette espèce, ainsi que l'avancée de notre projet qui a beaucoup évolué durant le semestre. 

 

Guide pour commencer un élevage de blob (c'est très simple) : 

Matériels : 

• un sclérote de blob ( la souche MALU marche très bien) 

• une pipette avec de l’eau du robinet
  

• des boîtes de pétri 

• de l’agar-agar 

• une balance

• une spatule

• des flocons d’avoine BIO(bio)

Explications :

     Pour pouvoir commencer votre élevage de blob, il vous faut dans un premier temps préparer le milieu dans lequel vous allez les maintenir. Pour cela il vous faut préparer des boîtes de pétri avec de l’agar à 2%. Essayez de préparer plusieurs boîtes dès le début pour pouvoir anticiper les futures multiplications, le blob se développeveloppant très vite. Pour conserver les boîtes de pétris,tri placez-plus longtemps, conservez-les dans un frigo.frigo tête en bas (gélose vers le haut) pour limiter l'assèchement. 

     Après avoir coulé les boîtes avec votre agar chauffé, laissez-les refroidirreposer un moment à température ambiante (l'agar gélifie en dessous de 60°C) mais attention à ne pas perdre l’humidité des boîtes. Une fois que les boîtes ont refroidi, vous pouvez positionner le sclérote sur l’agar. Pour pouvoir réactiver le blob, il faut humidifier le papier sur lequel il est positionné. Attention, il ne faut pas mettre directement l’eau sur le blob, mais bien sur le papier à côté. De plus, seules quelques gouttes suffisent (2-3 suivants la taille du sclérote), il ne faut pas noyer le blob ou inonder la boîte. Après avoir fait cela, refermez la boite et positionnez la à l’obscurité (le blob n’aime pas trop la lumière). 

     Pour le nourrissage, je vous conseille de ne pas en mettre le jour où vous les réveillez mais attendez plutôt le lendemain pour vérifier s'ils se sont bien réveillés. En terme de quantité de flocons d’avoine à mettre, la première semaine vous pouvez mettre quelques flocons dans la boîte à l’aide d’une pince, il ne faut pas en mettre beaucoup dès le début, c’est souvent la nourriture qui amène les problèmes (champignons/bactéries). Quand vous voyez que le blob se déplace de plus en plus, vous pouvez au fil des multiplications augmenter la quantité de nourriture.

Guide pour faire un sclérose (c'est simple aussi) : 

Après avoir pris la main sur l’élevage de blob, vous allez sans doutes vouloir essayer de créer des sclérotes (état de dormance du blob). 

Matériel : 

• un blob en bonne santé (sans champignons ou bactérie dans sa boite) 

• papier-filtre (je conseille le filtre à café = 100% de réussite) 

• une boîte de pétri neuve 

• une spatule

Explications :   

     Le but des sclérotes est de faire rentrer son blob en dormance pour pouvoir le conserver plus longtemps ou pourquoi pas en donner pour que d'autres personnes commencent un élevage. 

     Pour faire cela, vous allez prélever un bout de blob (assez dense si possible) et le positionner sur le papier-filtre humide. Placez le papier-filtre avec le blob dans une nouvelle boîte propre. Vous devez au moment où le blob quitte l’agar, et se retrouve sur le papier-filtre, enlevez l’agar (pour éviter qu’il n’y retourne). Une fois que le blob est sur le papier, il va petit à petit se dessécher avec le papier pour devenir un sclérote. 

     Je vous conseille de faire tout au long de votre élevage des sclérotes. En effet, une invasion de champignons peut vite arriver et donc si vous avez des sclérotes de côté vous pouvez reprendre votre élevage sans problème.

     J’espère que vous avez compris mes deux guides, vous pouvez continuer de regarder notre page, il y a des photos en plus, cela pourrait être plus parlant. Si vous avez des questions sur la maintenance des blobs vous pouvez me contacter je me ferais un plaisir de vous aider :) ( Rafael.Huertas@etu.sorbonne-universite.fr ) 

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Rapport 14/10/2022 :

Aujourd’hui nous sommes allés au GreenLab pour voir si nous pouvions réveiller des souches de Physarum polycephalum afin de pouvoir s'entraîner sur la maintenance de l’espèce.

-> On peut voir ici un sclérote de blob. Une des caractéristiques de cet organisme est qu’il peut entrer en phase de dormance (qui peut durer des mois voir des années si les conditions pour sa survie ne sont pas réunies)

Après avoir récupéré des boîtes de pétri déjà préparées avec de , nous avons réveillé les souches sous une hotte pour pouvoir garder le milieu le plus stérile possible.

Pour pouvoir réveiller les souches, il suffit juste d’humidifier le papier sur lequel est le sclérote. Ainsi, le blob va se réveiller et aller ensuite se balader dans la boîte de pétri à la recherche de nourriture. 

Pour pouvoir surveiller le réveil et pouvoir leur donner à manger, nous avons décidé de ramener les souches chez nous pendant le week-end. 

Rapport 17/10/2022 : 

Pendant le week-end, les souches se sont bien réveillées mais se déplacent très lentement, voire stagnent sur le papier.  Nous avons déposé les blobs au Greenlab pour voir s' ils reprennent une croissance normale. 

Rapport 19/10/2022 :

Nous sommes venus au laboratoire pour voir comment allaient les blobs. Les deux souches ne se développent plus du tout et prennent une couleur blanchâtre synonyme de mort de l’organisme. Plusieurs facteurs pourraient expliquer cela : les températures, les conditions ne sont pas adéquates pour le développement de l’organisme; le transport des blobs pourrait aussi expliquer cet événement (choc thermique); où simplement le fait que les sclérotes n’étaient pas fiables…

On voit sur cette photo que les souches ne se développent plus et sont de couleur blanche.

  On a donc décidé de réveiller trois autres souches de localités différentes présentes dans le stock de sclérotes du laboratoire, 2 blobs “Malu” du CNRS et une souche “Mikado” japonais qui est connue pour être très rapide.

  Après avoir choisi les souches à réveiller, il faut donc préparer le milieu dans lequel nous allons les maintenir. Pour cela, il nous faut de l’agar agar et de l’eau que nous allons monter à ébullition et ensuite verser dans les boîtes de pétri le mélange lorsqu’il est encore chaud.

                                         
Gauche : L'Agar Agar, c'est ce qu'on utilise pour préparer nos boite de petri; Droite : Boite de petri après avoir coulé l'agar

Je me suis entraîné à faire la préparation pour quelques boîtes de pétri avec pour ratio 1g d’agar pour 100ml d’eau. J' ai ensuite préparé d’autres boîtes avec le mélange que M.Hubert m'avait préparé au préalable.  

Préparation de plusieurs boites de pétri sous la hotte 

Une fois que l'agar a refroidi, nous pouvons poser les sclérotes dessus et les humidifier afin de réveiller les blobs.

Voici à quoi ressemble la boite de petri lorsqu'on démarre le réveil d'un blob

Nous les avons ensuite enfermés avec du papier aluminium pour pouvoir les garder dans l'obscurité (car les blobs grandissent plus vite dans l'obscurité), en attente de leur réveil afin de les nourrir par la suite. 
Pour information, pour les nourrir, nous utilisons des flocons d'avoine BIO (les blobs raffolent de l'avoine).

Reportage le 20/10/2022 :

Changement de problématique (à expliquer) 
Nous avons aussi décidé de contacter Madame Dussutour pour lui poser quelques questions afin de savoir par exemple quel répulsif elle utilisait lors de ses expériences sur Physarum polycephalum. 

Reportage 21/10/2022 :

Ce vendredi, nous sommes passés pour nourrir les blobs et voir leur développement. Les deux souches "Malu" du CNRS, se sont réveillées très rapidement et sont déjà en recherche de nourriture, j'en ai donc mis dans leur boîte. Quant à la souche japonaise "Mikado", aucun signe de réveil sur la boite, j'ai tout de même mis quelques flocons d'avoine pour peut-être "stimuler" son déplacement/réveil. 

Rapport 22-23/10/2022 : 

Ce week-end, j'ai fait des tests avec des ponts sur une souche AVA que je possède chez moi depuis quelques semaines pour m'entraîner à la maintenance de l'espèce.  

J'ai pris deux échantillons de ma souche mère, une passera sur un pont de 2 cm et une autre sur un pont de 4 cm.

J'ai commencé par créer les ponts à base d'agar (les ponts étant très petits, l'agar était plutôt fragile et se cassait facilement). Pour pouvoir être précis dans la découpe j'ai fait des structures en papier afin de respecter les distances.

On peut voir sur la photo les deux challengers que j'ai choisis pour faire le test ainsi que les feuilles me permettant de faire les ponts.
Après avoir tout préparé, je dispose les deux blobs, les ponts et l'avoine (qui symbolisent l'arrivée) sur une boîte de petri sèche afin d'éviter l'évasion des blobs lors du test. 

J'ai préparé mon appareil photo sur un trépied et j'ai décidé de prendre des photos toutes les 30 minutes pour voir l'avancée des blobs… départ annoncé à 11h pile (samedi).

On peut voir sur la vidéo des images de 11h à 23h du samedi (toutes les 30 minutes environ) et la toute dernière image est à 8h30 le dimanche.

Plusieurs problèmes/imperfections sont à relever. Tout d'abord, on peut voir dans la vidéo que le blob perd beaucoup trop de temps à descendre de sa plateforme d'origine, les quantités d'agar agar n'étant pas les mêmes (il faudra faire attention à cela lors des vraies expériences que nous prévoyons de faire). Il y a ensuite les facteurs lumière et température qui entrent en jeu, en 12h de déplacement (le samedi), il y avait un peu de lumière dans la pièce et surtout une température de 19 à 20 °C, alors que de 23h à 8h30, la pièce était plongée dans le noir à une température allant de 17°C à 18°C. On voit que le blob s'est déplacé beaucoup plus rapidement la nuit que le jour, il faudra garder les mêmes conditions dans nos futurs tests. ( Il faut savoir que cette souche AVA est censée être au top de sa forme à 24°C)  

Nous voulions partir sur des ponts de 4 cm de longueur et 1 cm de largeur mais avec mes tests, je pense qu'il serait plus judicieux de faire des ponts de 2 cm de longueur et 1 cm de largeur. Ce sera plus simple à faire et plus rapide à traverser pour le blob. D'autre part, je pense que le blob du pont à 4 cm était moins développé de base que celui du pont à 2 cm. Il faut donc aussi s'assurer que les blobs sont tous développés au même niveau.

Image du test avec le pont de 2 cm de longueur

Image du test avec le pont de 4 cm de longueur

Image montrant le problème des différentes hauteurs des plateformes d'agar

On ne peut pas vraiment se baser sur mes tests car j'ai commis beaucoup trop d'erreurs. Mais pour le déplacement de 23h à 8h30 : 

                   Image du test à 23h le samedi                                                             Image du test à 8h30 le dimanche

On voit que sur une durée de 9h30, le blob a presque traversé l'entièreté du pont de 2 cm. De plus on peut voir en dessous de la boite que le blob était arrivé depuis un bon moment (je pense que le blob a mis moins de 8h pour faire toute la traversée). Le temps que mettrait le blob nous inquiétait pour le bon déroulement de nos tests, mais si on réalisait de bonnes conditions, le blob peut faire en quelques heures le déplacement. 

On voit sur cette image que le blob est déjà sur la plateforme depuis un certain temps...

Choses à retenir pour les prochains tests : 

• maintenir les mêmes conditions tout au long du test
• faire attention à la quantité d'agar entre les différentes plateformes
• avoir des blobs développés au même niveau. 

Rapport mois de Novembre :

Pendant le mois de novembre, nous avons bien avancé sur nos recherches. Dans un premier temps, nous avons accéléré notre manière de multiplier nos souches de blobs. En effet, nous avons suivi la technique mise en place par Mme Dussutour, il s’agit de doubler presque tous les deux jours la colonie en coupant la moitié de la boîte. Mais avec cette technique vient l'arrivée de plusieurs problèmes comme l’invasion de champignons, bactéries impactant nos blobs…

Voici un florilège de photos des meilleures contaminations que nous avons eu : 

Mais malgré tout cela nous avons tout de même réussi à multiplier notre souche : 

Préparation de toutes nos boites de pétri avant de multiplier nos blobs

 On peut voir ici la méthode mise en place pour multiplier au plus vite nos blobs. Chaque souche est coupée en deux pour être remise dans une autre boite. 

Nous nous sommes ensuite intéressés au polluant auquel le blob pourrait être confronté dans son milieu naturel. En effet, en s’inspirant de l’étude de Mme Dussutour, nous nous sommes demandé si le blob pouvait, comme avec le sel, acquérir une résistance à un polluant qu’il pourrait rencontrer et l'empêcher d’accéder à sa nourriture dans la nature. 

Nous avons donc cherché différents polluants qu'il pourrait être intéressant de tester sur nos blobs pour voir comment ils réagissent. 

Nous avons donc pensé à la bouillie bordelaise, au cuivre, au plastique ou encore au sel de déneigement. Ensuite nous avons lancé des tests sur ces polluants.  ( nous avons pensé à d’autres polluants comme la nicotine, le fer ou encore tout type de carburant mais nous avons fait avec ce qu’on avait a disposition dans le laboratoire et ce qui était le plus simple à utiliser.)

Nous avons donc fait plusieurs préparations d'agar avec les différents polluants. Nous les avons coulées dans des boites carrés pour pouvoir ensuite faire des ponts. 

Nous avons ensuite préparé les différents tests :

On peut voir que pour la BB (bouillie bordelaise), le blob a essayé de traverser mais n'est pas allé jusqu'au bout. Pour le test avec le plastique, on voit que le blob passe facilement, en effet il ne fait qu'éviter le plastique et se déplace normalement sur l'agar donc ce test n'est pas très intéressant. Pour le cuivre et le sel, on voit que le blob n'essaye même pas de toucher le pont, il fuit directement vers l'opposé. 

Nous avons ensuite fait un deuxième test pour déterminer quel polluant serait le plus intéressant à observer, nous avons donc retenu la BB. 

Pendant la recherche du polluant, nous avons aussi cherché un moyen de pouvoir enregistrer en direct le déplacement du blob. De pouvoir faire des photos toutes les 30 minutes pour pouvoir après faire des timelapses et voir le déplacement des blobs sur les ponts. Nous avons appris l'existence d’un outil que possède le Fablab pouvant nous être utile pour faire cela: la Rasberry. Nous avons aussi cherché une boîte pouvant garder l’humidité pour les tests et en même temps pouvant faire office de support pour la caméra. 

Voici notre première installation pour faire nos tests :

Pour faire nos premiers tests, nous avons été obligés de faire 4 tests dans une même boîte pour pouvoir voir tous nos tests sur la caméra. Nous devons faire ces tests sur 15 blobs différents quotidiennement sur 5 jours pour observer un apprentissage et une possible amélioration à la recherche de nourriture.

Fin novembre, nous avons eu nos premiers résultats sur nos tests, on peut les voir sur l'image de droite.                                  Ces tests nous ont permis de voir plusieurs problèmes... Dans un premier temps, la proximité entre les tests est un problème car les participants préfèrent fusionner entre eux plutôt que de traverser le pont. Ensuite, il y a le problème de la lumière, on sait que le blob n'aime pas la lumière mais pour avoir des bonnes photos nous avons dû mettre des lampes pendant toute la durée du test. Les blobs seraient donc stressés par la lumière ce qui les empêcherait de traverser le pont. 

On peut voir sur cette photo que les blobs vont directement se fusionner entre eux. On peut tout de même voir que certains blobs essayent ou ont essayé de passer sur les ponts. De plus on a observé que nous nous étions trompé sur les concentrations de BB dans les ponts. Ainsi, nous devons donc faire des nouveaux tests en corrigeant toutes nos erreurs. 

Voici le timelapse de nos tests : Timelapse Tests BB (avec une erreur concentration)

Choses à retenir pour les prochains tests : 

• Chercher un moyen de faire des tests séparément pour obliger les blobs à aller sur le pont
• Garder de l'obscurité lors des tests pour limiter les stress qu'ont les blobs.

Rapport début décembre : 

Après avoir observé nos premiers résultats, nous avons dû trouver un autre moyen de faire notre expérience tout en conservant un taux de stress minimal pour le blob. Nous avons donc cherché une autre “boîte” pour faire nos tests ainsi qu’un moyen de pouvoir contrôler la luminosité à l’intérieur. Notre première idée était d’utiliser des minuteurs sur nos lampes, mais après en avoir parlé à Steve, nous avons trouvé une machine nous permettant de remplir toutes nos demandes : le Phytotron. 

Voici notre nouvelle installation, nous avons donc changé notre boîte en plastique pour un Phytotron. Cette machine nous permet de contrôler la température ainsi que la luminosité dans la boîte. Ainsi nous pouvons allumer les lumières exclusivement lors de la prise de photo et le reste du temps le blob est dans l’obscurité, qu’il préfère pour se développer. 

On voit sur cette photo comment nous avons fait l’installation à l’intérieur. Nous n'avons conservé que deux étages de grilles, une positionné en hauteur pour pouvoir mettre notre caméra, et une plus basse pour pouvoir poser nos tests. 

Dans un premier temps, nous avons fait nos témoins, donc nos blobs sur un pont d'agar sans polluants avec cette installation. Voici le timelapse des témoins : Timelapse Témoin 

Nous avons ensuite fait des tests avec 21 mg de BB. En effet, avec nos précédents tests avec 1g de BB, nous n'avons pas eu de résultats concluants. (Voir timelapse = Timelapse tests Bouillie Bordelaise 1g) Peut être cela était lié à la concentration de BB qui serait trop élevée, nous avons donc baissé la concentration. 

Voici le timelapse de nos test avec 21mg de BB dans les ponts : Timelapse Tests 21mg de Bouillie Bordelaise

Outre nos multiples tests, notre colonie de blob se multiplie très bien depuis qu'on applique la technique de Mme Dussutour. Nous n'avons jamais eu autant de blobs que depuis ces derniers jours.