La communauté de gammares de l'Oise peut-elle fragmenter le microplastique en nanoplastique ?

Rapport du 6/10/2022 - 1ère séance en groupe

Contexte :

Notre question s'origine dans l'article suivant : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7393071/
Les auteurs remarquent qu'une espèce de gammare : Gammarus duebeni, est capable de fragmenter le microplastique (polyéthylène) en nanoplastique.nano plastique. Ce phénomène pose des enjeux environnementaux importants car le nanoplastiquenano plastique est toxique et peut s'infiltrer dans les cellules. La séance du jour nous a permis de poser les principaux enjeux de notre sujet. 
Gammarus duebeni est une espèce que l'on retrouve plutôt en Irlande et dans une moindre mesure dans les eaux douces britanniques. Nous nous demandons donc si ce phénomène de fragmentation peut se retrouver chez d'autres espèces de gammares en Ile-de-France ou dans les environs.

Pour tester notre hypothèse, nous avons décider de réaliser une expérience. Bien que pour le moment encore en cours de réflexion, nous souhaitons introduire des gammares dans une cuve d'eau douce et leur donner du microplastique pendant une certaine durée puis doser le nanoplastiquenano plastique ou microplastique par la suite.
Afin de réaliser notre expérimentation, nous souhaitons suivre plusieurs indications données dans l'article cité plus haut. Plusieurs problématiques se posent de suite :
- Les auteurs de l'article indiquent avoir cherché au sein même des organismes la présence de nanoplastique,nano plastique, ce qui peut laisser entendre que ces particules restent piégées dans les parois digestives des gammares. Ceci est a prendre en compte pour une analyse correcte de nos particules. Nous avons initialement pensé doser la présence de nanoplastiquenano plastique dans l'eau, hors peut-être que nous n'aurons rien si on ne prend pas en compte le fait que le plastique peut encore résider dans les gammares. Pour cela, au moins deux possibilités sont avancées : mesurer microplastique et nanoplastiquenano plastique et en faire le rapport afin de voir s'il manque de la matière, ou bien lyser les gammares à la fin de l'expérience pour récuperercupérer le nanoplastiquenano plastique (nous n'avons pas encore trouvé comment faire cela).
- Il y a une grande diversité de classification du microplastique et nanoplastiquenano plastique vis-à-vis des tailles que cela représente. Nous allons surement nous référer à la classification utilisée dans l'article pour nos mesures.
- Nous ne connaissons pas la dynamique du micro- et nanoplastiquenano plastique dans l'eau, est-ce que cela sédimente rapidement ? Cela dépend par ailleurs de l'induction ou non d'un courant dans la cuve pour gammares. De plus, on ne sait pas comment le plastique va réagir et s'agréger à la matière organique générée par les gammares.

L'expérience :

Pour notre expérience, nous avons au moins 3 conditions différentes à réaliser :
- ControleContrôle 1 : eau douce sans gammares
- ControleContrôle 2 : eau douce issue du lieu de capture de gammares sans gammares
- Condition 1 : eau douce issue du lieu de capture de gammares avec gammares

Le contrôle 2 a pour objectif de vérifier que c'est bien la présence de gammares qui permet la fragmentation du microplastique et non des micro-organismes ou des conditions spécifiques de l'eau. Le contrôle 1 permet de vérifier, dans le cas ou le contrôle 2 et la condition 1 montrent toutes deux que le plastique est fragmenté, que l'eau ne permet pas seule de fragmenter le plastique (auquel cas, on montrera alors le rôle prépondérant de l'eau douce issue du lieu de capture de gammares dans le processus de fragmentation). Il pourra exister d'autres hypothèses concernant ce résultat : protocole exp., matériel utilisé ou autre..
Le nombre de réplicat est encore indéterminé, de même que la réalisation dans le temps des manipulations. Selon nos connaissances actuelles, nous pensons que réaliser une condition dure 4 jours - temps donné par l'article auquel nous nous référons. On peut donc choisir de réaliser toutes les conditions en même temps, sachant que cela peut poser un problème à la fin des 4 jours lorsque nous aurons toutes les manipulations à faire pour doser le plastique.

Dans tous les cas, il nous semble important de rapidement essayer des manipulations autour du microplastique pour, lorsque l'expérience commencera, être confiant sur la méthode que nous aurons choisi pour le mesurer. Il faut donc prévoir d'acheter du microplastique (polyéthylène?) rapidement. 

Pour la semaine prochaine :

Notre groupe étant composé de 5 personnes, nous nous sommes répartis les recherches autour du sujet.
1. Le mode de vie des gammares 
2. Le plastique et sa dégradation
3. Le repérage des lieux pour capturer les gammares
4. La logistique autour de notre expérimentation
5. La gestion d'un planning pour réaliser l'expérience
6. Le plan d'expérience/protocole

L'ensemble des informations sera ajouté ici. Il semble aussi important de se fixer la semaine prochaine sur la forme de la cuve et sa fabrication pour essayer rapidement de mesurer le microplastique dans un environnement qui sera proche - voir identique - à celui que nous utiliserons au cours de l'expérimentation. De même, il serait utile de se fixer une deadline pour réaliser l'expérience afin d'avancer à la bonne vitesse.

Rapport du 12/10/2022 - 2nde séance en groupe

Le mode de vie des gammares :

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Le plastique et sa dégradation

La première question à laquelle répondre est le choix du plastique à utiliser. Dans l'expérience de l'article dont nous nous inspirons, le plastique utilisé est le polyéthylène car il s'agit de l'un des polymères les plus courants dans les produits de soins personnels et, par conséquent, dans les systèmes aquatiques (par la pollution). De plus il est probable qu'il soit consommé par les gammares car sa densité et inférieure à celle de l'eau, il flotte donc en surface, et les gammares sont capables de collecter de la nourriture à la surface de l'eau, y compris des lentilles d'eau flottantes.
Nous avons donc décidé d'utiliser aussi ce plastique, quant à la taille des morceaux à introduire dans les cuves il s'agirait d'éléments de 15 à 40 micromètre de diamètre. pour nous en fournir nous comptons soit sur :
-Nous en fournir directement au fablab
-Acheter un rouleau sur internet puis le découper nous même grâce à une micro broyeuse
-Ou grâce à une ponceuse suivi d'un tri par filtre pour ne sélectionner que les tailles qui nous intéressent

Techniques de mesures de la quantité de plastique à la fin de l'expérience :
Nous sommes passés par différentes idées, pour compter/déterminer la quantité de nano ou micro plastique à la fin de l'expérience et ainsi conclure sur la question de la fragmentation du microplastique par nos gammares.
Dans tous les cas, nous souhaitons faire des observations au microscope pour avoir un support visuel sur lequel se baser. Il faudra aussi faire des études statistiques.
Nous pensons aussi peut être colorer les microplastiques afin de faciliter l'observation, notamment si nous faisons une lyse des gammares

-Filtre à nano ou micro particules. On prélève des petit volumes v d'eau de la cuve qu'on filtre puis on compte/pèse la quantité de fragments trouvés et on compare à ce qui a initialement été introduit. 
-Evaporation : On prélève v puis on fait s'évaporer l'eau : il reste les micro et nano plastiques et dedans on mesure la masse / compte + obs microscope.
Si il y a fragmentations on observe un plus grand nombre de fragments et ils seront plus petits
-Centrifugation : On prélève v et on fait centrifuger : dans le culot il y aura des micro et dans le surnageant de nano -> facilite le comptage

Lieu de capture des gammares :

Après investigation sur les lieux de capture initialement déterminés, il y a effectivement présence de gammares dans la rivière. Nous avons donc décidé de prendre ce lieu comme lieu de capture. Nous pensons donc maintenant au moyen le plus efficace de récupérer les gammares et les transférer jusqu'au SU.

La logistique autour de notre expérimentation

Taille et fonctionnement des cuves : 5L avec bulleur pour oxygéner les cuves (montage en série pour utiliser moins de bulleur)
Faire du microplastique : Ultra turax pour "mixer" à haute vitesse le plastique et obtenir des micro particules (mais taille non contrôlable) ou utiliser une ponceuse pour avoir de la "poussière" de plastique qui fera office de micro particules (mais pareil, taille incontrôlable)
Transport et stockage des gammares : Transport dans des bouteilles en plastique transparentes industrielle contenant l'eau du milieu de l'organisme et dépôt des gammares le plus vite possible dans les cuves sur le campus Pierre et Marie Curie. Prévoir, en plus, des bouteilles contenant uniquement l'eau du milieu où évolue l'organisme pour ne pas manquer de liquide dans les cuves
Nourriture pour gammares : gammares --> détritivores --> nourriture pour poisson/crevettes suffira

Gestion d'un planning pour l'expérimentation / protocole / plan d'expérimentation 

Suite à divers échanges et réflexions, nous sommes en train de construire le plan d'expérimentation (qui doit être fini pour le 20 octobre). Il parait préférable pour des questions pratiques, et de maximisation de la randomisation, de réaliser notre expérimentation en plusieurs temps successifs tout en conduisant nos différentes conditions en parallèles. 
Nous avons 3 conditions (4 si nous décidons de tester une condition contrôle en plus : a savoir eau claire + gammare sans introduction de plastique - dans le but de vérifier que les gammares ne rejettent pas naturellement du nanoplastiquenano plastique dans l'environnement). La durée d'une condition est de 4 jours (l'intervalle entre les mises en place des 4 jours d'expérimentation est nommé rotation). Nous souhaitons donc réaliser une fraction de chaque condition en parallèle des autres, et de répéter ces fractions tous les 4jours jusqu'à avoir assez de mesures pour une analyse statistique viable.

Si l'on souhaite réaliser 15 répétitions de chaque conditions, on se retrouve à 15x3 ou 15x4 : soit 45 ou 60 mesures au total. 
Dans le cas des 3 conditions, nous aurions idéalement besoin de 15 cuves pour gammares. On peut alors faire 5 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 3 rotations soit 12 jours au total. 
Dans le cas des 4 conditions, nous aurions idéalement besoin de 16 cuves pour gammares. On peut alors faire 4 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 4 rotations soit 16 jours au total. 

Sachant qu'il nous faudra randomiser à la fois les emplacements des conditions a chaque rotation et les expérimentateurs venant s'occuper des gammares et des cuves vides.

Globalement, il reste la question des gammares :
- Doit-on les chercher à chaque rotation dans la rivière ou bien les stocker en attendant leur mise en cuve ? Il semble que dans les deux cas, cela pose des limites concernant l'interprétation des résultats. La solution la plus pratique est tout de même le stockage. Il faut par ailleurs faire attention à la possible présence d'un parasite du gammare, et qui réduit son métabolisme.
- Combien de fois les nourrir avant les 4 jours, combien de fois par jour ? On note ici une information encore jamais explicité dans le document : les gammares, une fois l'expérience lancée (donc durant les 4 jours d'expérimentation) ne sont pas nourris. Le début de l'expérimentation est consécutif d'une induction de microplastique type polyéthylène dans toutes les cuves.