Quels sont les effets de l'oestrogène sur une population de gammares de l'Oise ?

Rapport du 6/10/2022 - 1ère séance en groupe

Contexte :

Notre question s'origine dans l'article suivant : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7393071/
Les auteurs remarquent qu'une espèce de gammare : Gammarus duebeni, est capable de fragmenter le microplastique (polyéthylène) en nano plastique. Ce phénomène pose des enjeux environnementaux importants car le nano plastique est toxique et peut s'infiltrer dans les cellules. La séance du jour nous a permis de poser les principaux enjeux de notre sujet. 
Gammarus duebeni est une espèce que l'on retrouve plutôt en Irlande et dans une moindre mesure dans les eaux douces britanniques. Nous nous demandons donc si ce phénomène de fragmentation peut se retrouver chez d'autres espèces de gammares en Ile-de-France ou dans les environs.

Pour tester notre hypothèse, nous avons décidé de réaliser une expérience. Bien que pour le moment encore en cours de réflexion, nous réussirons à introduire des gammares dans une cuve d'eau douce et leur donner du microplastique pendant une certaine durée puis doser le nano plastique ou microplastique par la suite.
Afin de réaliser notre expérimentation, nous suivrons plusieurs indications dans l'article cité plus haut. Plusieurs problématiques se déclinent de suite :
- Les auteurs de l'article indiquent avoir cherché au sein même des organismes la présence de nano plastique, ce qui peut laisser entendre que ces particules restent piégées dans les paroisses digestives des gammares. Ceci est à prendre en compte pour une analyse correcte de nos particules.Nous avons pensé à doser la présence de nano plastique dans l'eau, hors peut-être que nous n'aurons rien si on ne prend pas en compte le fait que le plastique peut encore résider dans les gammares. Pour cela, au moins deux possibilités sont avancées : mesurer microplastique et nano plastique et en faire le rapport afin de voir s'il manque de la matière, ou bien lyser les gammares à la fin de l'expérience pour récupérer le nano plastique (nous n'avons pas encore trouvé comment faire cela).
- Il y a une grande diversité de classification du microplastique et nano plastique vis-à-vis des tailles que cela représente. Nous allons surement nous référer à la classification utilisée dans l'article pour nos mesures.
- Nous ne connaissons pas la dynamique du micro- et nano plastique dans l'eau, est-ce que cela se sédimente rapidement ? Cela dépend par ailleurs de l'induction ou non d'un courant dans la cuve pour gammares. De plus, on ne sait pas comment le plastique va réagir et s'agréger à la matière organique générée par les gammares.

L'expérience :

Pour notre expérience, nous avons au moins 3 conditions différentes à réaliser :
- Contrôle 1 : eau douce sans gammares
- Contrôle 2 : eau douce issue du lieu de capture de gammares sans gammares
- Condition 1 : eau douce issue du lieu de capture de gammares avec gammares

Le contrôle 2 a pour objectif de vérifier que c'est bien la présence de gammares qui permet la fragmentation du microplastique et non des micro-organismes ou des conditions spécifiques de l'eau. Le contrôle 1 permet de vérifier, dans le cas ou le contrôle 2 et la condition 1 montre toutes deux que le plastique est fragmenté, que l'eau ne permet pas seule de fragmenter le plastique (auquel cas, on montrera alors le rôle prépondérant de l'eau douce issue du lieu de capture de gammares dans le processus de fragmentation). Il pourra exister d'autres hypothèses concernant ce résultat : protocole exp., matériel ou utilisé autre..
Le nombre de réplicats est encore indéterminé, de même que la réalisation dans le temps des manipulations.Selon nos connaissances actuelles, nous pouvons réaliser une condition d'une durée de 4 jours - temps donné par l'article auquel nous nous référons. On peut donc choisir de réaliser toutes les conditions en même temps, sachant que cela peut poser un problème à la fin des 4 jours lorsque nous aurons toutes les manipulations à faire pour doser le plastique.

Dans tous les cas, il nous semble important d'essayer rapidement des manipulations autour du microplastique pour, lorsque l'expérience commencera, être confiant sur la méthode que nous aurons choisie pour le mesurer. Il faut donc prévoir d'acheter du microplastique (polyéthylène ?) rapidement. 

Pour la semaine prochaine :

Notre groupe étant composé de 5 personnes, nous sommes répartis les recherches autour du sujet.
1. Le mode de vie des gammares 
2. Le plastique et sa dégradation
3. Le repérage des lieux pour capturer les gammares
4. La logistique autour de notre expérimentation
5. La gestion d'un planning pour réaliser l'expérience
6. Le plan d'expérience/protocole

L'ensemble des informations sera ici ajouté. Il semble aussi important de se fixer la semaine prochaine sur la forme de la cuve et sa fabrication pour essayer rapidement de mesurer le microplastique dans un environnement qui sera proche - voir identique - à celui que nous utiliserons au cours de l'expérimentation. De même, il serait utile de se fixer un délai pour réaliser l'expérience afin d'avancer à la bonne vitesse.

Rapport du 12/10/2022 - 2ème séance en groupe

Le mode de vie des gammares :

Les gammares vivent en eau douce pour la plupart des espèces, dans des eaux entre 2 et 20°C. Ils supportent bien les changements de pH (entre 4 et 9,9) et la pollution dans une certaine mesure. En revanche, ils ont besoin d'une eau bien oxygénée. 

Ils se nourrissent de détritus organiques ou bien inorganiques, dont notamment des feuilles mortes. Les juvéniles peuvent aussi être cannibales s'ils n'ont pas assez de nourriture. 

La reproduction à lieu toute l'année, chaque femelle peut avoir jusqu'à 6 "portées" par an. Les juvéniles sont la forme majoritaire toute l'année, leur croissance dure 2 à 3 semaines l'été, elle est ralentie en hiver. L'espérance de vie des gammares est entre 1 et 2 ans. 

La densité est maximale en septembre puis décroît pour atteindre la minimale en février-mars. 

Le plastique et sa dégradation

La première question à laquelle répondre est le choix du plastique à utiliser. Dans l'expérience de l'article dont nous nous inspirons, le plastique utilisé est le polyéthylène car il s'agit de l'un des polymères les plus courants dans les produits de soins personnels et, par conséquent, dans les systèmes aquatiques (par la pollution). De plus il est probable qu'il soit consommé par les gammares car sa densité et inférieure à celle de l'eau, il flotte donc en surface, et les gammares sont capables de  collecter de la nourriture à la surface de l'eau, y comprend des lentilles d'eau flottantes.
Nous avons donc décidé d'utiliser aussi ce plastique, quant à la taille des morceaux à introduire dans les cuves il s'agirait d'éléments de 15 à 40 micromètre de diamètre. pour nous en fournir nous comptons soit sur :
-Nous en fournissons directement au fablab
-Acheter un rouleau sur internet puis le découper nous même grâce à une micro broyeuse
-Ou grâce à une ponceuse suivi d'un tri par filtre pour ne sélectionner que les tailles qui nous intéressent

Techniques de mesures de la quantité de plastique à la fin de l'expérience :
Nous sommes passés par différentes idées, pour compter/déterminer la quantité de nano ou micro plastique à la fin de l'expérience et ainsi conclure sur la question de la fragmentation du microplastique par nos gammares.
Dans tous les cas, nous souhaitons faire des observations au microscope pour avoir un support visuel sur lequel se baser. Il faudra aussi faire des études statistiques.
Nous pensons aussi pouvoir colorer les microplastiques afin de faciliter l'observation, notamment si nous faisons une lyse des gammares

-Filtre à nano ou micro particules. On prélève des petits volumes d'eau de la cuve qu'on filtre puis on compte/pese la quantité de fragments trouvés et on compare à ce qui a été introduit initialement. -Evaporation : On prélève v puis on fait s'évaporer l'eau : il reste les micro et nano plastiques et dedans on mesure la masse / compte + obs microscope. Si il ya des fragmentations on observe un plus grand nombre de fragments et ils seront plus petits -Centrifugation : On prélève v et on fait centrifuger : dans le culot il y aura des micro et dans le surnageant de nano -> facilite le comptage 

Lieu de capture des gammares :

Après enquête sur les lieux de capture initialement déterminés, il y a effectivement présence de gammares dans la rivière. Nous avons donc décidé de prendre ce lieu comme lieu de capture. Nous pensons donc maintenant au moyen le plus efficace de récupérer les gammares et les transférer jusqu'au SU.

La logistique autour de notre expérimentation

Taille et fonctionnement des cuves : 5L2L avec bulleur pour oxygéner les cuves (montage en série pour utiliser moins de bulleur)
Faire du microplastique : Ultra turax pour "mixer" à haute vitesse le plastique et obtenir des micro particules (mais taille non contrôlable) ou utiliser une ponceuse pour avoir de la "poussière" de plastique qui fera office de micro particules (mais pareil, taille incontrôlable)
Transport et stockage des gammares : Transport dans des bouteilles en plastique transparentes industrielles contenant l'eau du milieu de l'organisme et dépôt des gammares le plus vite possible dans les cuves sur le campus Pierre et Marie Curie.Prévoir, en plus, des bouteilles contenant uniquement l'eau du milieu où évolue l'organisme pour ne pas manquer de liquide dans les cuves
Nourriture pour gammares : gammares --> détritivores --> nourriture pour poisson/crevettes suffira

Gestion d'un planning pour l'expérimentation / protocole / plan d'expérimentation 

Suite à divers échanges et réflexions, nous sommes en train de construire le plan d'expérimentation (qui doit être fini pour le 20 octobre). Il est préférable pour des questions pratiques, et de maximisation de la randomisation, de réaliser notre expérimentation en plusieurs temps successifs tout en conduisant nos différentes conditions en parallèles. 
Nous avons 3 conditions (4 si nous décidons de tester une condition contrôle en plus : a savoir eau claire + gammare sans introduction de plastique - dans le but de vérifier que les gammares ne rejettent pas naturellement du nano plastique dans l'environnement). La durée d'une condition est de 4 jours (l'intervalle entre les mises en place des 4 jours d'expérimentation est nommé rotation).Nous allons donc réaliser une fraction de chaque condition en parallèle des autres, et de répéter ces fractions tous les 4 jours jusqu'à avoir assez de mesures pour une analyse statistique viable.

Si l'on souhaite réaliser 15 répétitions de chaque conditions, on se retrouve à 15x3 ou 15x4 : soit 45 ou 60 mesures au total. 
Dans le cas des 3 conditions, nous aurions besoin idéalement de 15 cuves pour gammares. On peut alors faire 5 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 3 rotations soit 12 jours au total. 
Dans le cas des 4 conditions, nous aurions besoin idéalement de 16 cuves pour gammares. On peut alors faire 4 mesures par condition en parallèle et réaliser ainsi l'expérience en 4 rotations soit 16 jours au total. 

Sachant qu'il nous faudra randomiser à la fois les emplacements des conditions à chaque rotation et les expérimentateurs venant s'occuper des gammares et des cuves vides.

Globalement, il reste la question des gammares :
- Doit-on les chercher à chaque rotation dans la rivière ou bien les stocker en attendant leur mise en cuve ? Il semble que dans les deux cas, cela pose des limites concernant l'interprétation des résultats. La solution la plus pratique est tout de même le stockage. Il faut par ailleurs faire attention à la possible présence d'un parasite du gammare, et qui réduit son ressentiment.
- Combien de fois les nourrir avant les 4 jours, combien de fois par jour ? On note ici une information encore jamais explicite dans le document : les gammares, une fois l'expérience acquise (donc durant les 4 jours d'expérimentation) ne sont pas nourries.Le début de l'expérimentation est consécutif à une induction de microplastique de type polyéthylène dans toutes les cuves.

20/10/2022

Nous avons continué à réfléchir à comment mesurer nos quantités de micro et nano plastiques mais nous sommes rendus compte que notre expérience était bien trop compliquée à mener avec nos moyens et nos délais, donc nous avons dû modifier notre problématique.
Nous avons reçu notre matériel :

• 15 cuves dans lesquelles nous allons contenir nos gammares
• Des bulleurs que nous allons monter en série
• Des filtres de 45microm pour filtrer nos éléments 

Entre temps Léopold et Lucie sont allés au Fablab afin de découper du plastique en micro plastique dans l'idée de faire des tests : qu'est-ce qu'on peut obtenir et peut on l'observer au microscope ? 

Nouvelles pistes de problématiques :

• Comment les parasites de gammares influent sur leur comportement (les guident vers la lumière)
• Quel est l'effet du nitrate sur une population de gammares (toxicité)
• Quel est l'effet d'une forte concentration de microplastique sur une population de gammares ?
• Quel est l'effet d'hormones sexuelles sur les gammares ?

27/10/2022

Nous avons préféré la problématique "Quel est l'effet d'une forte concentration de microplastique sur la survie et le comportement d'une population de gammares de l'Oise ?"
Thomas est allé récupérer des gammares le matin même

Objectifs de la séance :

• Préparer les cuves : les découper transversalement, mise en place du système en série d'oxygénation
• Préparer les micro plastiques : au fablab on découpe le toits de nos cuves en petits bouts, on les brois puis grâce à l'ultra turax on créer des micro plastiques entre 20 et 40 microm (pour qu'ils passent dans nos filtres). Malheureusement l'ultra turax n'as pas fonctionné sur nos plastiques. Fautes de moyen nous avons du passer à notre plan de secours et décider d'une autre problématique

Nous nous intéressons maintenant à l'effet d'une forte quantité d'œstrogène sur une population de gammares. On en retrouve dans nos rivières à cause de la pollution par le rejet de pilules contraceptives et par nos urines. Chez les poissons, cette hormone entraine des phénomènes de féminisation. Moins d'études ont été menées quant à son effet sur les arthropodes mais on peut hypothétiser qu'il y en a et c 'est ce que nous allons chercher à prouver.

Pour cela nous allons introduire dans nos cuves des quantités plus ou moins importantes de pilules contraceptives que nous auront broyé. 
Nous allons mesurer chez nos gammares ;

• Leur survie : on compte le nb de morts
• Mobilité en longueur: on pose chaque lot de 5 individus sur une feuille quadrillé, on filme leurs mouvements et on compte le nombre de fois qu'ils changent de carreaux 
  On fait qql secondes de vidéos et plusieurs répliques pour chaque vu 
  Hugo propose : 10sec X 10 fois pour chaque gammare de chaque cuve -> 250 min en tout (soit 50min chacun au moins)
• Mobilité en hauteur : même principe mais cette fois le quadrillage n'est pas placé sous la cuve mais sur un des cotés 
• phénomène d'accrochage (les gammares en bonne santé ont tendances à s'accrocher aux bords de nos cuves)
• Temps de pause entre les mouvements 
• Morphologie 
• Isolement / comportement reproducteur
  

02/11/2022
J'ai vérifié que les gammares étaient toujours vivantes, les ai observé (phénomènes de reproduction, nous avons des larves, d'accrochages ...) et j'ai testé les protocoles (quelle taille de quadrillage ressort le mieux à la vidéo, plutôt utiliser un quadrillage ou une éprouvette graduée pour la mesure en hauteur...)

Rapport du 18/11/2022

Les gammares ont été dispersés dans les cuves contenant un même volume d'eau (à préciser)2L) et disposées de manière à ce qu'aucune condition X1 ne soit à coté d'une condition X2 (pas de cuves ou il y a une forte concetrationconcentration d'hormone à côté) pour randomiser et éviter que les facteurs extérieures (lumière, température) n'influencent uniquement les cuves d'une condition. Les pillules ont été mises dans les cuves (hort condition contrôle). On a mis x pillules dans les cuves forte concentration et y pillules dans les cuves à faible concentration de manière à ce qu'il y ait un facteur 10 entre les concentrations de ces deux conditions (concentration d'oestrogène à mettre). Un montage en série de bulleurs pour oxygéner l'eau à également été effectué pour que les conditions d'oxygénation soit optimales dans chaques cuves. On va laisser les cuves pendant 6 jours.

Rapport du 24/11/2022

Après réflexion, on va mesurer :

• Mobilité en longueur: on pose chaque lot de 5 individus sur une feuille quadrillé, on filme leurs mouvements et on compte le nombre de fois qu'ils changent de carreaux. On fait qql secondes de vidéos et plusieurs répliques pour chaque vu. On capturera 30 secondes de vidéos pour chaque cuve s'il y a beaucoup de mouvement durant la prise ou alors 1 minute si les gammares ne bougent pas beaucoup.
  
• Nombres de gammares liés : le fait que certains gammares se déplacent à 2 traduit un comportement reproducteur qui pourra nous permettre probablement de faire un lien entre concentration d'hormone et comportement reproducteur.
• Nombre de mort par cuves : survie des gammares

Nous ne savons pas encore si nous allons indivisualiser nos observations par rapport à chaque gammare dans la cuve ou alors faire une moyenne des données obtenues de chaque cuve, on penche plus pour une moyenne car, statistiquement c'est plus simple à traiter, mais il y a quand même des désaventages. On a commencé à faire les mesures. On a prélevé les gammares dans 6 cuves aléatoirement pour les mettre dans 6 boites (XxY) remplie avec 100 mL d'eau de la rivière posées sur des feuilles cadriées (1cm=1carreau). Il y a donc 6 gammares par cuves. On a mis des objets opaques autour des boites pour éviter que les gammares ne soient trop influencés pendant l'enregistrement par la lumière. On a mis le téléphone à une hauteur de X cm de manière à enregistrer les 6 cuves en même temps. On agit les gammares avec une baguette en bois après qu'on les ait tous mis dans les cuves, on laisse reposer 2 minutes et enfin on enregistre la vidéo pendant 1 minute. On a fait tous les enregistrement aujourd'hui, cela fait donc 3 minutes d'enregistrement en tout pour 24 cuves à observer.

Plan expérimental :

Les gammares péchées le 17/11/2022 dans l'Oise on été disposées aléatoirement dans 18 cuves de 2L d'eau de l'Oise non traitée.
3 conditions expérimentales :
-Contrôle : aucune modifications des paramètres, c'est le témoin de l'expérience (6 cuves C)
-Low : ajout d'1/2 pilule contraceptive broyée : faible concentration d'oestradiol (6 cuves L)
-High : ajout de 5 pilules contraceptive broyées : forte concentration d'oestradiol (6 cuves H)

La concentration en oestardiol d'une pilule est de 30microgramme.
Dans les conditions L il y a donc 15 microg/2L soit une concentation de 7,5 microg/L d'oestradiol
Dans les conditions H la concentration est de 150 microg/2L soit 75 microg/L d'oestradiol (10x plus)

Dans chaque cuve sont introduit aléatoirement 4 gammares + 1 couple de gammare présentant un comportement pré-copulatoire (donc 6 gammares/cuve en tout).
Chaque cuve est oxygénée par un bulleur
Les cuves sont disposées de sortes à ce qu'aucune ne soit à coté d'une condition similaire afin de randomiser et éviter que les facteurs extérieures (lumière, température) n'influencent uniquement les cuves d'une condition :

Le 18/11/2022 nous avons lancé l'expérience : broyé et introduit les quantités de pilules dans chaque cuve, ainsi qu'une petite quantité de nourriture pour crevettes broyées (3 granules par cuve).
Nous avons fait un relevé de résultats à 3 reprises, chacune espacées d'une semaine et sans modifier aucune condition a part le rajout de nourriture. Cela nous permet d'observer l'évolution de la modification du comportement des gammares au cours du temps. Dates des relevés : 24/11, 01/12, 08/12

Protocole du relevé de données/observation :
-Nombre de mort par cuve
-Maintient ou nom du comportement pré-copulateur
-Mobilité : L'observation consiste à filmer en hauteur les gammares (séparées par cuves) au dessus d'une feuille quadrillée (carrées de 1cm) pendant 1min afin de compter le nombre de carreaux traversés par chaque gammare durant ce laps de temps.
Pour cela nous avons utilisé des réservoirs transparents  remplis d'eau de l'Oise non modifiée que nous avions en stock. Le déplacement des gammares de la cuve au réservoir d'observation vont leur provoquer du stress, afin d'homogénéiser la quantité de stress reçu par chaque individu avant de prendre la vidéo nous remuons l'eau du réservoir puis laissons reposer 2min.
Les vidéos de chacune des cuves durent 1 min.

Après les observations :
Chacun de nous 5 a analysé les vidéos et nous avons collecté nos données dans un tableur afin de pouvoir les exploiter.