Extraction du chitosane et élaboration d'un film alimentaire biosourcé

Informations

• Lucie Granjeon, Stéphanie Siek, Rozelin Yilmaz
• lucie.granjeon@etu.sorbonne-universite.fr ; stephanie.siek@etu.sorbonne-universite.fr ; rozelin.yilmaz@etu.sorbonne-universite.fr 
• Licence 3 monodisciplinaire chimie 
• 25/03/2024 - 12/04/2024

Contexte

A l'heure où la chimie a besoin de se détacher du prétrosourcé et alors que 8 millions de tonnes de déchets de crustacés sont produits par an, la valorisation de ces déchets en chitosane est une alternative prometteuse. Ce biopolymère présente en effet de nombreuses propriétés et applications potentielles, notamment la capacité de former des films, ce qui ouvre la voie à des applications aussi bien dans le domaine de l'agroalimentaire que dans le domaine médical. 

Objectifs

• Montrer que les déchets alimentaires sont une source de biopolymères qui peuvent être une alternative aux films alimentaires en polyéthylène
• Test et comparaison de la capacité du film à préserver un fruit
• Évaluation de la biodégradabilité du film et de sa solubilité, et comparaison avec les films en polyéthylène

Matériel

• Papier pH
  
• Barreau aimanté
• Plats de cuisine en verre borosilicaté trempé
• Mélangeur de cuisine
• Boîte de pétri en verre
• Creuset (taille : 125μm, porosité 1)
• Fiole à vide
  
• Coupelle de pesée
• Spatule
• Pipettes graudées de 10 mL
• Fioles jaugées
• Bécher de 250 mL
• Micropipette 1000-5000 μL
• Flacons

Produits utilisés :

• Chitosane de faible poids moléculaire
• pastilles de NaOH
• HCl 37% 
• NaOCl

Machines utilisées

• Sorbonne fixe
• Centrifugeuse réfrigérée (modèle : Sirena ; fabricant : Afi)
• Etuve universelle ventilée 112 litres (300°C) (modèle : XUE112 ; fabricant : France étuves)
• Agitateur magnétique chauffant (fabricant : IKA RCT)
• Pompe à vide (modèle : N022AN ; fabricant : KNF)
• Balance d'analyse max 320 g à 0,1 mg (modèle : ABS 320-4M ; fabricant : Kern)
• Spectromètre FT-IR (modèle : Spectrum Two ; fabricant : PerkinElmer)

Étapes du projet :

Étape 1 : Réaliser un film à partir de chitosane commercial ⁽¹⁾⁽³⁾

Étape 2 : Extraire le chitosane des déchets de crevettes ⁽²⁾

Étape 3 : Réaliser un film à partir de extrait de chitosane 

Étape 4 : Etude de la biodégradabilité (hors Fablab), de la capacité à préserver une banane (hors Fablab) et de la solubilisation du film dans l'eau

Journal de bord

25/03/2024 : (R+L+S)

Objectif : préparer une solution pour des films à base de chitosane commercial en premier test pour voir obtenir comment ils se décollent

• Protocole suivi pour la formation de 3 films avec chitosane commercial :
  • Préparer une solution acide dans une bécher en verre de 250mL :
    100mL eau distillée + 2 mL acide lactique prelevé à la pipette graduée 
    masse d'eau pesée : 100,4154 g 
    
    
  • Agitation magnétique de la solution pour homogénéiser (quelques minutes)
  • Ajouter 1g de chitosane et laisser sous vive agitation pendant 1h à température ambiante
  • Prélever 30 mL, 25 mL et 47 mL de la solution et verser chacun de ces volumes dans des plats de cuisine:
    → Ayant un protocole pour 100mL de solution, nous avons choisi d'utiliser toute la solution pour préparer des films en testant différents moules et différentes épaisseurs
  • Laisser évaporer 48h à température ambiante sous la sorbonne. 
    

25/03/2024 Hors Fablab (S) :

Objectif : récupérer des déchets de crevettes et les faire sécher avant de commencer l'extraction de la chitine

• Mode opératoire suivi : 
  • • Décortiquer 200g de crevettes entières cuites (penaeus vannamei) et récupérer les têtes et les carcasses
    • Effectuer 5 lavages avec de l'eau du robinet filtrée à température ambiante : immerger les carcasses dans les récipients et mélanger pendant 1 min, vider l'eau et recommencer. 
      → L'eau des premiers lavages et très rose et trouble et n'est quasiment plus colorée au bout du 5e lavage
      → Le nombre de lavages a été déterminé en fonction de la couleur de l'eau de lavage
    • Rincer à l'eau déminéralisée : placer les carcasses dans une passoire et verser de l'eau déminéralisée de façon à bien rincer les déchets
  • Egoutter et mettre à sécher : placer sur une plaque de four et mettre à sécher au four domestique dans les conditions suivantes :
    - consigne du four réglée sur 30°C, température à l'intérieur du four contrôlée avec un thermomètre 25°C, durée : 4h
    - consigne du four réglé sur 40°C, température à l'intérieur du four : 30°C, durée : 5h
    → En milieu de séchage, les têtes ont été émiétées pour accélérer le séchage
• Résultat : 
  • • masse de caracasse récupérée après séchage : 20g → manque par rapport à la quantité estimée (environ 70g)

27/03/2024 (R) : 

Objectifs :   - préparer la solution de soude pour la 1ère étape de l'extraction
                  - Broyer les déchets de crevettes
                  - Décoller les films en chitosane et relancer une autre préparation

• Mode opératoire suivi pour la préparation de la solution de NaOH 2M  :
  → Un ratio solvant solide de 1:6 est nécessaire. En attendant la masse finale des déchets obtenus, nous avons préparé 250mL de solution de NaOH 2M (pour environ 40g de déchets séchés augmentés)
  • Peser 17,664 g de pastilles de NaOH dans un flacon de 250mL
  • Peser 220,82 g d'eau distillée dans un bécher
    
  • Ajouter l'eau dans le flacon, boucher et agiter
    
• Démoulage des films réalisés le 25/03/2024 (chitosane commercial) :
  • 25 mL : épaisseur trop fine pour pouvoir décoller le film
  • 30 mL : pas assez épais donc cassant
  • 47 mL : bonne épaisseur mais difficile de le décoller
    → préparation de nouvelles solutions à partir du chitosane commercial 
• Mode opératoire suivi pour la préparation d'une nouvelle solution de film avec le chitosane commercial : 
  
  • même protocole que celui du 25/03
  • répartition de la solution dans les moules : 
    - test de tremper la banane dans la solution → échec
    - 30mL de solution dans le moule de taille moyenne 
    - test de verser de la solution sur du papier cuisson → n'adhère pas 
    - 20mL dans une boîte de pétri en verre de 20cm de diamètre
• Broyage des déchets de crevettes : 
  • à partir d'un mixeur/broyeur de cuisine en plusieurs fois de façon à obtenir la poudre la plus fine possible
    après broyage : 
    

27/03/2024 Hors Fablab (S) : 

Objectif : Récupérer plus de déchets de crevettes pour l'extraction

• Mode opératoire suivi : même protocole que le 25/03/2024 
  • Température : consignée réglée sur 40°C, température à l'intérieur du four : 30°C 
  • Durée de séchage : 8h
• Résultats : 
  • masse de déchets avant séchage : 276g
  • masse déchets après séchage : 59,104g 
    → même espèce de crevettes mais plus gros calibre, masse récupérée supérieure à celle estimée, besoin de repréparer de la solution de NaOH 2M pour la déprotéinisation

28/03/2024 (L) : 

Objectifs : - broyer la suite des déchets récupérés et séchés de la veille
- repréparer une solution de NaOH 2M pour la déprotéinisation pour en avoir suffisamment 

• Broyage des carcasses de crevettes avec le mixeur de cuisine :
  • Masse avant broyage : 59,104 g
  • Masse après broyage : 58,836 g
    → masse totale de déchets récupérés : 
• Mode opératoire suivi pour la préparation de la solution de NaOH 2M pour 30 g de carcasses :
  • Peser 13,331 g de pastilles de NaOH
  • Peser 164,90 g d'H ₂ O distillée 
  • Additionner l'eau et la soude dans un même bécher
  • Conserver la solution dans un flacon

29/03/2024 (R+S) : 

Objectifs : - 1ere étape de l'extraction : déprotéinisation
- Démoulage des films préparés le 27 mars 

• Mode opératoire suivi pour l'étape de déprotéinisation :
  • Additionner la totalité de la poudre de déchets de crevettes et mL de solution de NaOH 2M (rapport solide solvant 1:6) dans un bécher en verre de 250mL 
  • Ajouter un barreau aimanté et laisser sous agitation pendant 1 h à 30°C sur un agitateur magnétique chauffant → mélanger assez épais et visqueux
  • Filtrer sur creuset → la pompe chauffe rapidement et la solution bouche le fritté et manque de temps : tout rassembler dans un bécher recouvert de parafilm et choix d'une nouvelle méthode pour récupérer le solide la prochaine fois 
• Résultats du démoulage des films : film dans la boîte de pétri : difficultés à décoller, se déchirer
  film dans le plat de cuisine : bords un peu difficiles et bien collés mais décollage du film quasi entier réussi
  mode opératoire pour décoller le film : faire les contours du film avec un outil pointu puis à l'aide d'une pince en métal décoller délicatement un bord, terminer de tirer le film hors du moule à la main est plus simple et éviter de la casser. 

04/02/2024 : (R)

Objectifs : - fin de la déprotéinisation 
- 2e étape de l'extraction : déminéralisation

• Mode opératoire suivi pour la fin de l'étape de déprotéinisation : 
  • • filtration à l'aide d'un filtré → échec 
    • Centrifuger les solutions à 3500 tr/min pendant 20 minutes à 25°C
    • Jeter le surnageant
    • Récupérer le résidu solide et le laver à l'eau distillée jusqu'à pH neutre, centrifuger entre chaque lavage, 10 lavages réalisés, perte de produit
• Mode opératoire suivi pour préparer la solution d'HCl 1.5M 
• Mode opératoire suivi pour l'étape de déminéralisation : Ajouter tout le solide dans une solution de HCl 1.5M avec un ratio solide solvant de 1:12

03/04/2024 (S) : 

Objectif : Etape de décoloration 

• Préparation de la solution de NaOCl 5% :
• Mode opératoire suivi pour l'étape de décoloration :
  • Mélanger la totalité de la poudre de chitine obtenu dans une solution de NaOCl 5% avec un ratio solide : solvant de 1:10.
• Résultats : La décoloration a fonctionné 

04/04/2024 (S) : 

Objectifs : - préparation d'une solution de NaOH 60% pour l'étape de déacétylation
- Etape de déacétylation de la chitine en chitosane
- Caractérisation IR de la chitine 
- préparation de solutions de films avec le nouveau protocole qui utilise du glycérol

• Mode opératoire suivi pour la préparation d'une solution de NaOH 60% : 
  • Peser 60g de pastilles de NaOH dans une fiole jaugée de 100mL 
  • Compléter au trait de jauge avec de l'eau distillée : → très exothermique !! 
  • Boucher et agiter → perte de volume donc rajouts réguliers d'eau distillée jusqu'au trait de jauge puis également juste avant l'utilisation de la solution
• Mode opératoire suivi pour l'étape de déacétylation :
  • Dans un bécher, ajouter toute la chitine obtenue dans mL de solution de NaOH 60% prélevée à l'expériencette graduée 
  • Agiter pendant 1 h à température ambiante avec un agitateur magnétique
  • Centrifuger et laver le mélange à l'eau distillée jusqu'à pH neutre : 
    1. 10 000rpm pendant 10min 
     → manque de temps, seulement 2 rinçages réalisés et pH encore très basique (14 avec papier pH)
  • Sécher le mélange à 85°C pendant une nuit à l'étuve
• Mode opératoire suivi pour la préparation de films avec le nouveau protocole à base de glycérol : 
• Manipulations concernant le séchage des films :
• Caractérisation IR-ATR de la chitine : 

05/04/2024 : (L+S)

Objectifs : - Caractérisation IR du produit obtenu après déacétylation
- Démoulage des films préparés le : 

• Caractérisation IR ATR du produit obtenu : 
  
  rouge : spectre IR-ATR du chitosane commercial
  noir : spectre IR - ATR du chitosane extrait 
  → on note une bonne superposition des 2 spectres qui confirme que le produit obtenu est bien du chitosane. La bande amide à 1622cm-1 est plus intense sur l'extrait de chitosane que le commercial, il est donc moins déacétylé. Nous notons également la présence de "bandes supplémentaires" sur le chitosane extrait qui semble indiquer que celui-ci n'est pas parfaitement pur. 
  

08/04/2024 : (L+S) 

Objectifs :  - Démoulage des films réalisés le : 
- préparation de nouvelles solution de films avec et sans glycérol avec 0.5g de chitosane commercial pour choisir le protocole et tester les meilleures conditions avant la réalisation du film avec le chitosane extrait

• Démoulage des films : Les films en glycérol se décollent beaucoup plus facilement comme le montre le vidéo : https://youtu.be/W0EesuDGnuk 
• Plusieurs formations de films lancées :
  • Avec glycérol :
  • Sans glycérol : 

04/09/2024 : (L)

• Décollement des différents films :
  • Le film avec le glycérol se décolle plus facilement que celui sans glycérol. On choisit donc de réaliser le film à partir de notre chitosane avec le protocole comportant du glycérol
    
• Formation du film à partir de notre chitosane :
  • Masse de chitosane : 0,43 g
  • Masse de glycérol : 0,129 g
  • Masse d'eau distillée : 21,5 g
  • Masse d'acide acétique : 215 μL
  • Verser dans un bécher muni d'un barreau aimanté, le glycérol, l'eau distillée, l'acide acétique et le chitosane
  • Agiter pendant 45 min à 380 tr/min tout en chauffant à 60°C
  • Verser la solution dans la boîte de pétri
  • Placer cette boîte à l'étuve pendant 3h à 45°C

10/04/2024 : (L+S)

Objectif :  - Voir si un film est obtenu avec le chitosane extrait 

• Le solvant s'est évaporé et le chitosane a reprécipité → pas de film obtenu
• 
•  préparation d'une solution en laissant agiter plus longtemps et en ajoutant plus d'acide pour favoriser la solubilisation : meilleur aspect de la solution qui reste très différent de celle avec le chitosane commercial mais mélange quasi complètement homogène. 

12/04/2024 : (S)

Objectif : - voir les modifications de protocole ont permis d'obtenir un film avec le chitosane extrait

• Pas de film obtenu avec le chitosane extrait → étude de la biodégradabilité et de la capacité à préserver une banane à partir des échantillons de films à base de chitosane commercial 
  

Conclusion : 

• Nous avons pu montrer qu'il est possible de faire des films alimentaires à partir de chitosane commercial et que le protocole qui utilise du glycérol est celui qui nous a permis d'obtenir les meilleurs résultats. 
• Nous avons aussi réussi à extraire la chitine des déchets de crevettes et déacétylé en chitosane. Cependant, il serait utile de recommencer l'extraction en utilisant une autre technique que la centrifugation pour les rinçages et partir d'une masse de déchets beaucoup plus importante pour que l'impact des pertes de masses lors des rinçages soit négligable. De plus, l'étape de déacétylation est la plus cruciale et sensible aux conditions expérimentales. Il s'agit de l'étape la moins détaillée des publications que nous avons trouvées. Il pourrait être pertinent de tester de nouvelles conditions de déacétylation en jouant sur la concentration en NaOH et/ou la température dans le but de mieux déacétylé le chitosane obtenu et réussir à former un film. 

Les références :

1. Cazón, P., Morales-Sánchez, E., Velázquez, G., & Vázquez, M. (2022).
   Measurement of the water vapor permeability of chitosan films: a laboratory experiment on food
   packaging materials. Journal of Chemical Education, 99(6), 2403–2408.
   https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.2c00449
2. Aldila, H., Asmar, Fabiani, V. A., Dalimunthe, D. Y., & Irwanto, R. (2020). The effect of
   deproteinization temperature and NaOH concentration on deacetylation step in optimizing extraction
   of chitosan from shrimp shells waste. IOP Conference Series, 599(1), 012003.
   https://doi.org/10.1088/1755-1315/599/1/012003

3. Siripatrawan, U., Vitchayakitti, W. (2016). Improving functional properties of chitosan films as active food packaging by incorporating with propolis, Food
   Hydrocolloids 61 (695-702) https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2016.06.001