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Extraction d'ADN de cellules végétales

But :

 En biologie moléculaire, de nombreuses techniques se basent sur l'analyse et le traitement de l'ADN (Acide DesoxyriboNucléique), à ne pas confondre avec l'ARN (Acide RiboNucléique). 

C'est le cas de la Polymérase Chain Reaction (PCR), Southern Blot, utilisation d'enzymes de restriction, hybridation moléculaire...

Pour ce faire, il est nécessaire d'isoler l'ADN de son environnement (cellule, tissus) pour obtenir d'un échantillon pur et et quantité suffisante pour servir de base pour les techniques suivantes.  

MéthodeProtocole d'extraction :

[1]  (extraction d'ADN génomique et aplification des gènes dactine et cycline D des plantes Arabidopsis Thaliana et Tomates) https://www.unine.ch/files/live/sites/physiologievegetale/files/shared/documents/TP-PCR.pdf

Protocole :

  • CoupezCouper une pièce de feuille (1-2cm2) dans un tube eppendorf
  • BroyezBroyer les feuilles fortement pendant 15 secondes.
  • AjoutezAjouter 500 μL de tampons d’extraction
  • Vortex 5 secondes.
  • CentrifugezCentrifuger l’extrait pendant 5 minute5min a 13'000 rpm (4°C)
  • Prélevezlever 350 μl du surnageant dans un nouveau tube eppendorf
  • AjoutezAjouter 350 μl d’isopropanol
  • InversezInverser le tube une dizaine de fois et laissezlaissetr précipiter l’ADN pendant 2 min
  • CentrifugezCentrifuger pendant 15 min à 13'000 rpm (4°C)
  • JetezJeter le surnageant, ajoutezajouter 400 μl d’ethanol 80%.
  • CentrifugezCentrifuger pendant 5 min à 13'000 rpm
  • EnlevezEnlever le surnageant et laissezlaisser sécher le culot (10min environ)
  • AjoutezAjouter 50 μl d’ H2O distillé
  • Vortex

VOrtexL'isopropanol :provoque l'agrégation et la précipitation de l'ADN dans la solution.

Le Vortex est un matériel utilisé en bilogiebiologie moléclaireculaire pour mélanger des solutions notamment dans lesdes microtubes. Il est composé d'un socle lourd ou se situe le moteur de 'l'appareil. Au-dessus, se trouve un réceptacle en caoutchouc ou l'on pose le tube a votexer. [2]

Précisions :

Le tampon d'extraction est habituellement préfabriqué, il sert à rompre les membranes cellulaires et nucléaires, maintenir un pH optimal tout au long de l’extraction n, sauvegarder l'intégrité de l'ADN et prévenir sa dégradation, Séparer l'ADN des débris cellulaires et des contaminants. [2]

 

Protocole de fabrication du tampon d'extraction de cellules végétales : [3]

  • Tampon d'extraction CTAB (pH 8)
    • Tris-Cl 100 mM, pH 8,0
    • EDTA 20 mM, pH 8,0
    • NaCl 1,4 M
    • 2 % (p/v) CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium)
    • 1 % PVP 40 000 (polyvinylpyrrolidone)
    • 0,3 % de 2-β-mercaptoéthanol (ajouté directement avant utilisation dans une hotte)
  • Chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v)
  • NaCl 6 M
  • Acétate de potassium 3 M
  • Glace froide
  • Alcool isopropylique à 100 %
  • Éthanol à 70 %
  • Réhydratation dans un tampon TE 1 × (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 ; EDTA 1 mM, pH 8,0, autoclavé)

 

Bibliographie :

[1] Extraction d'ADN génomique et amplification des gènes d'actine 2 et Cycline D des plantes Arabidopsis Thaliana et Tomates, Laboratoire de Physiologie Végétale,Université de Neuchâtel : https://www.unine.ch/files/live/sites/physiologievegetale/files/shared/documents/TP-PCR.pdf

[2] Vortex, Wikipédia : https://fr.wikipedia.org/wiki/Vortex_(biologie_mol%C3%A9culaire)

[3] Fabriquer et utiliser des tampons d'extraction ADN courants, Fourni-Labo : https://www.fourni-labo.fr/tutoriel/comment-fabriquer-et-utiliser-des-tampons-d-39-extraction-d-39-adn-courants-2023-08-19

 

 

 

 


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