Isolation de l'ADN de Plantes Dehydratés
Des techniques utilisées précédemment consistaient a lyophiliser les plantes avant extraction.
Avantages
Dans ce processus de lyophilisation il n'est pas nécessaire de laisser le tissu dans le congélateur. Cette technique nous permet de pouvoir facilement transporter et traiter mécaniquement le tissu.
Inconvénients
Les lyophilisateurs sont relativement chères et ont une capacité limité. La lyophilisation nécessite plusieurs jours. Des erreurs dans l'opération peuvent causer la dégradation de l'ADN.
Il existe une autre méthode qui consiste a déshydrater les tissus de plantes et traiter et extraire l'ADN ayant une masse moléculaire élevée. Elle peut être utilisé sur une grande variété de plantes et sur un grand nombre d'échantillons.
Matériel
- Déshydrateur alimentaire
- Moulin à café
- Billes de verre
- Mélangeur de peinture
- Petites pochettes en tissue 7,6cm x 12,7 cm
Tampon d'Extraction
- 100 mM Tris-HCl pH 8
- 50 mM EDTA pH 8
- 500 mM NaCl
- 1.25% SDS (w/v)
- 0.38 g sodium bisulfite par 100 mL (tampon ajouté avant utilisation = TE tampon)
- 50 mM Tris-HCl pH 8
- 10 mM EDTA
- acétate de potassium 5M
Méthodes
Prétraitement
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- Collecter les tissues de feuilles (3 à 5g poids avant séchage)
- Les placer dans des sachets fermés puis dans le déshydrateur et sécher à 45-55°C pendant 12 à 24 heures.
- Broyer le tissu sec et placer dans un tube de centrifugation de 50mL de polypropylène contenant des billes de verre (10 g).
- Mélanger avec un mixeur de peinture jusqu'à obtenir une poudre fine (30s à 3min)
- Les billes de verre sont laissées dans le tube pendant la première centrifugation et ils sont éliminées avec le culot de centrifugation ou ils sont enlevées et rincées pour une réutilisation futur.
- Les tissus fibreux (riz...) sont broyés avec un moulin a café (20 à 40s) puis transféré dans un tube de 50mL
- Après le prétraitement des tissus des plantes on commence l'isolation (d’après Dellaporta et al. (1983))
Isolation