Méthode ELISA (Enzyme-Linked Immuno Assay)

- Présentation - 

La méthode ELISA consiste à doser visuellement une molécule présente dans une solution : un anticorps. Pour faire simple : on choisit une molécule capable de se lier avec celle qu'on veut doser : l'antigène, qu'on dépose dans un bain / un puits. On ajoute ensuite dans ce même bain la solution contenant l'anticorps. Les antigènes et les anticorps vont alors se lier. On prend soin d'ailleurs de rincer le support entre chaque manipulation pour enlever l'excédent d'anticorps appliqué.  Généralement, on intègre un deuxième anticorps capable de produire de la couleur ou de la lumière (grâce à une enzyme). Enfin, l'ajout d'un substrat permet de provoquer la réaction lumineuse avec l'enzyme. La concentration en couleur perçue (à l’œil, au microscope, au colorimètre ou au spectrophotomètre...) permet alors directement de :

• conclure sur la présence ou non de l'anticorps dans la solution testée
  
• obtenir une estimation (plus ou moins précise) de la concentration de cet anticorps (peut demander de réaliser une gamme étalon au préalable)

Méthode ELISA Direct ci-dessus (source en cliquant sur l'image)

Applications :

Définitions :

1. Antigènes : toute substance reconnue comme étrangère par notre système immunitaire
2. Anticorps : protéine capable de réagir avec un antigène
3. Substrat : le plus souvent une substance solide support d'un réactif
   

Matériel :

• Plaques de microtitration 96 puits à fond plat

- Les différentes versions -

Il existe 4 versions différentes de la méthode ELISA en fonction de la précision recherchée et du contexte du test (approche quantitative ou qualitative).

• ELISA Directe

Fonctionnement :

La méthode Direct n'utilise pas d'intermédiaire entre l'antigène et l'anticorps porteur de l'enzyme. On applique l'un sur l'autre puis on ajoute un "substrat chromogène", c'est à dire un révélateur qui permet de savoir si des antigènes ont été retenus.

Procédure :

1. Fixer les antigènes (ou les anticorps selon le test souhaité). L'expérience s'effectue la plupart du temps sur des plaques de microtitration. Le fond des puits est recouvert d'un matériau capable d'absorber les antigènes déposés à sa surface, et donc de les fixer. On dit que les antigènes s'adsorbent.
   
2. Laisser incuber la plaque permet de fixer durablement les antigènes dans le fond du puits.
3. Rincer le puits afin de retirer l'excédent d'antigènes non fixés.
4. Ajouter l'anticorps lié à l'enzyme capable de réagir avec le substrat. C'est à ce moment que des couples antigène-anticorps vont se former.
5. Rincer le puits afin de retirer l'excédent d'anticorps non fixés à des antigènes.
6. Ajouter le substrat chromogène permettant de déclencher la réaction lumineuse avec l'enzyme.
7. Mesurer la concentration de l'anticorps en utilisant l'absorption de la solution.

--- A FINIR A PARTIR D'ICI ---

• ELISA Indirecte

Fonctionnement :

La méthode Indirecte utilise quant à elle un intermédiaire en plus de l'antigène et de l'anticorps que l'on veut doser. C'est désormais un anticorps secondaire qui porte l'enzyme et qui vient se fixer sur l'anticorps primaire que l'on fixe en d'abord à l'antigène. Il est d'ailleurs possible que plusieurs anticorps secondaires se fixent à un anticorps primaire, ce qui permet d'accroître la précision du dosage.

Procédure :

1. Fixer les antigènes (ou les anticorps selon le test souhaité). L'expérience s'effectue la plupart du temps sur des plaques de microtitration. Le fond des puits est recouvert d'un matériau capable d'absorber les antigènes déposés à sa surface, et donc de les fixer. On dit que les antigènes s'adsorbent.
   
2. Laisser incuber la plaque permet de fixer durablement les antigènes dans le fond du puits.
3. Rincer le puits afin de retirer l'excédent d'antigènes non fixés.
4. Ajouter l'anticorps primaire. C'est à ce moment que des couples antigène-anticorps vont se former.
5. Laisser incuber la plaque permet de s'assurer qu'un maximum de liaisons antigènes-anticorps primaires se forment.
6. Rincer le puits afin de retirer l'excédent d'antigènes primaires (et autres) non fixés.
7. Ajouter l'anticorps secondaire lié à l'enzyme capable de réagir avec le substrat.
8. Laisser incuber ?
9. Rincer le puits afin de retirer l'excédent d'anticorps secondaires non fixés à des antigènes.
10. Ajouter le substrat chromogène permettant de déclencher la réaction lumineuse avec l'enzyme.
11. Mesurer la concentration de l'anticorps primaire en utilisant l'absorption de la solution.

• ELISA Sandwich

• ELISA Competition

Sources :

WikipédiaPasseport Santé

Microbiologynote