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Mise au point d’un échantillon d’eau venu de l’espace de prototypage de la cuve de la découpeuse laser (Omax) sur un milieu LB

Informations :

·         Alan Kernanec

·         alan.kernanec@sorbonne-universite.fr

  • FabManagers espace Biologie/Chimie

·         27/05/24

Contexte :

Nous voulons voir si l’échantillon d’eau qui provient de l’espace prototypage contient des bactéries ou des colonies spécifiques.

 

Objectifs :

Nous avons fait des tests sur un milieu gélosé LB qui est composé de agar-agar, de LB et d’eau distillé.

 

Consommables :

·         Agar-Agar

·         LB

·         Eau distillé

·         Cristal violet

·         Lugol

·         Ethanol

·         Fuchsine

·         Javel

 

Matériel et Machines utilisés :

·         Tube à essai

·         Ense de platine

·         P1000

·         Pipette pasteur en verre

·         Bécher

·         Bec bunsen

·         Agitateur magnétique

·         Boîte de pétri

·         Lame de microscope

·         Pince

·         Bac en verre

·         Microscope

·         Portoir

·         Poubelle DASRI

·         Balance de précision

 

 

Protocole :

 

1-    Préparation du milieux LB de volume 200mL dans une bouteille en verre.

2-    Mettre la bouteille dans l’autoclave. Pour la préparation de l’autoclave mettre un fond d’eau distillé au fond. Puis lancer le programme 20min à 121°C.

3-    Allumer la PSM et procéder au nettoyage de la surface. Par la suite annoter les boîtes de pétri (2 boîtes séparé en 6 parties et 2 boîtes en ensemencement en strie standard). Penser à mettre la date et la nature du milieu et rajouter T pour témoins et E pour échantillon.

4-    Par la suite, procéder au coulage des boîtes sous PSM et attendre qu’elles se solidifient.

5-    Puis procéder à l’ensemencement des boîtes comme indiqué ci-dessous :

 

 

image.png

 

6-    Puis mettre les boîtes retournés 24h à l’incubateur à 37°C.

7-    Observation des boîtes

8-    Lancer une coloration de Gram :

 

Procédure :

1.    Fixation : Fixer les bactéries sur une lame de verre en les chauffant légèrement. Cela peut être fait en passant la lame au-dessus d'une flamme.

2.    Coloration initiale : Appliquer le cristal violet sur les bactéries. Laisser agir pendant environ 1 minute.

3.    Fixation du cristal violet : Ajouter le Lugol (solution d'iode) sur le cristal violet. Laisser agir pendant environ 1 minute. Cette étape fixe le cristal violet dans la paroi cellulaire.

4.    Décoloration : Laver la lame à l'éthanol ou à l'alcool éthylique. Cela élimine le cristal violet des bactéries. La durée de décoloration doit être surveillée attentivement, car elle varie selon les types de bactéries.

5.    Contre-coloration : Appliquer la fuchsine sur les bactéries. Laisser agir pendant 1 minutes. La fuchsine colore les bactéries qui ont perdu le cristal violet.

6.    Lavage final : Rincer la lame à l'eau pour éliminer l'excès de colorant.

7.    Observation : Observer les bactéries au microscope. Les bactéries qui conservent la coloration violette sont appelées "Gram-positives", tandis que celles qui prennent la coloration safranine sont appelées "Gram-négatives".

Résultats :

·         Gram-positif : Bactéries avec une paroi cellulaire épaisse qui retient le cristal violet.

·         Gram-négatif : Bactéries avec une paroi cellulaire plus mince qui ne retient pas le cristal violet et prend la coloration rose.

9-    Et nous observation au microscope des Bacillus violet.