PCR (Polymerase Chain Reaction)

La PCR ou réréaction de polymépolymérisation en chaine, est un des élééléments favoris de la boîboîte àà outils des biologistes au laboratoire.

A la fois trètrès simple et d'une grande éléélégance, elle permet d'amplifier des séséquences d'acides nuclénucléiques variévariés.

Avant de commencer

Comme toutes les sciences, la biologie àà sa propre langue, donc pour se comprendre il nous faut dédéfricher un peu le vocabulaire.

Voici quelques clefs :

-les acides nuclénucléiques sont les supports de l'information génégénétique. Ils sont constituéconstitués de 4 briques universelles diffédifférentes nomménommées nuclénucléotides (A, C, G et T/U). AgencéAgencées en séséquence àà brin unique (ARN) ou àà double brin (ADN), ces briques repréreprésentent une information qui peut êêtre recopiérecopiée (c'est le principe de la PCR) ou bien décodédécodée par une machinerie spéspécifique àà base d'enzymes. Ces séséquences parfois extrêextrêmement longues sont fragiles et souvent enrouléenroulées de manièmanière poussépoussée sur elles-mêmêmes et autour de bobines protéprotéiques.

-la dédénaturation est un processus qui vise àà linélinéariser au mieux les séséquences d'acides nuclénucléiques pour les rendre accessibles aux enzymes. Dans le cas des ADN double brins, ces derniers s'éécartent partiellement en deux brins uniques reliéreliés par quelques points (comme les anneaux d'une chaines), donnant accèaccès àà chaque brin individuellement.

-l’l’appariement est le principe de complémentaritécomplémentarité des 4 diffédifférents nuclénucléotides dans les séséquences double brin d'ADN. Il se fait d'un brin àà l'autre entre nuclénucléotides complécomplémentaires qui se font face. C'est assez simple car il n'y a en fait qu'un appariement possible pour chaque nuclénucléotide : le A avec le T, et le C avec le G ! Donc par exemple pour une courte séséquence monobrin GATTACA, le brin complécomplémentaire est CTAATGT.

-les enzymes sont des machines àà base de protéprotéines hyper-spécialiséspécialisées, extrêextrêmement efficientes et trètrès diversifiédiversifiées. Elles sont génégénéralement spéspécifiques àà un petit nombre de molémolécules (nomménommé substrat) sur lesquelles elles se fixent pour réréaliser des opéopérations simples mais préprécises, avec un faible taux d'erreur. Par exemples elles peuvent tronçtronçonner une molémolécule, en fusionner deux bout àà bout, gégérer du stockage, libélibérer de l'éénergie, ou dans le cas de la TAQpolyméTAQpolymérase qui nous intéintéresse ici, réréaliser la copie d'une séséquence.

-la TAQpolyméTAQpolymérase est l'enzyme utiliséutilisée pour réréaliser la PCR. Elle se lie spéspécifiquement aux séséquences d'acides nuclénucléiques monobrin et cherche a recrérecréer le brin manquant.

Les éétapes

En quoi consiste la PCR : une enzyme nomménommée polymépolymérase va venir faire des trètrès nombreuses copies d'une séséquence modèmodèle d'acides nuclénucléiques.

On réréalise plusieurs éétapes àà des tempétempératures diffédifférentes dans un appareil appeléappelé thermocycleur. Le mémélange réréactionnel (Taq polymépolymérase, Mg2+ et parfois MgCl2, amorces, les 4 dNTP en excèexcès (A, T, C, G) et l’l’extrait d’d’ADN cible, tampon réréactionnel ) est placéplacé dans des microtubes et est soumis, plusieurs dizaines de fois, àà des cycles successifs. Le thermocycleur permet la programmation de chaque éétape des cycles. La réréaction PCR dure quelques heures (2 àà 3 heures pour une PCR de 30 cycles). 

Le nombre de cycles est typiquement inclus entre 25-35 cycles d'amplification. Plus on effectue de cycles, plus on augmente le risque d'avoir des contaminants au sein de la réréaction. Il est donc conseilléconseillé d'effectuer le nombre minimum de cycles nénécessaire afin de synthésynthétiser la quantitéquantité de produit désirédésirée.

Le protocole diffèdiffère en fonction du type de PCR àà effectuer :

PCR classique : 

1 : ÉÉtapes du cycle PCR

DéDénaturation thermique de l'ADN àà 95°95°C : permet de rompre les liaisons hydrogèhydrogène afin d'obtenir des matrices simple brin.

Hybridation des amorces àà 50°50°C-65°65°C : Les deux amorces contenues en large excèexcès s'hybrident lorsqu'elles rencontrent les séséquences complécomplémentaires. La tempétempérature permet aux liaisons de se reformer. Ainsi, plus la tempétempérature d'hybridation est levélevée, plus l'hybridation est sésélective et spéspécifique.

ÉÉlongation àà 72°72°C. La Taq polymépolymérase catalyse la réréplication àà partir des ADN monocatémonocaténaires amorcéamorcés de façfaçon sésélective (sélectivitésélectivité qui dédécoule du choix des amorces).

Exemple de conditions de cycles pour une Taq polymépolymérase.

ÉÉtape	TempéTempérature	Temps (min)	Cycles
DéDénaturation initiale	95°95°C	2	1
DéDénaturation	95°95°C	0,5 àà 1	25 àà 35
Hybridation	42°42°C àà 65°65°C	0,5 àà 1	-
Amplification	72°72°C	1	-
Amplification finale	72°72°C	5	1
Trempage	4°4°C	indéindéfini	1

2 : ÉlectrophorèÉlectrophorèse sur gel d'agarose : Ce principe repose sur l'attraction des acides nuclénucléiques chargéchargés nénégativement sous l'effet d'un champ éélectrique. Les acides nuclénucléiques migrent plus ou moins loin àà travers le gel en fonction de la masse des molémolécules (plus elles migrent loin plus elles sont petites car le maillage du gel se rétrérétrécit plus on se rapproche du pôpôle +)

3 : RévéRévélation : L'ADN est révélérévélé par une coloration au Bromure d'ééthidium ou un intercalant visible sous lampe UV (l'intercalant se lie aux acides nuclénucléiques et éémet une fluorescence)

PCR en temps réréel :

ÀÀ l'inverse du PCR classique, le PCR en temps réréel permet une quantification plus préprécise grâgrâce àà une mesure de l'amplification tout a long de la réréaction. On effectue la dédétection et la quantification de l'amplification àà chaque fin de cycle grâgrâce àà un signal fluorescent, un intercalant des acides nuclénucléiques (donc la valeur de la fluorescence est corrélécorrélée àà la quantitéquantité de produit amplifiéamplifié). Cette dédétection éélimine le besoin d'électrophorèélectrophorèse sur gel, ce qui permet d'ééconomiser du temps et de réréduire le potentiel de contamination.

Vu que la formation de produit peut êêtre détectédétectée dans la phase exponentielle du PCR lorsque la réréaction est la plus efficace, la quantification du matématériel de dédépart est plus sensible et préprécise.

Comparaison PCR Classique et PCR temps réréel

PCR classique	PCR en temps réréel
Visualisation du produit amplifiéamplifié par gel d'agarose aprèaprès sa production	Visualisation du produit amplifiéamplifié en temps réréel (pendant l'amplification) grâgrâce àà un instrument de dédétection
Ne mesure pas préciséprécisément l'ADN ou ARN de dédépart	Permet de mesurer le nombre de copies d'ADN ou d'ARN de dédépart (d'oùoù le nom de PCR "quantitatif")
Moins coûcoûteux, ne nénécessite pas d'instrument spéspécial	Plus coûcoûteux, nénécessite des instruments spéspéciaux
Principe basique de biologie molémoléculaire	Demande des compécompétences plus techniques

Facteurs pouvant affecter le succèsuccès de la technique de PCR :

- QuantitéQuantité d'enzyme utiliséutilisée

- Erreur de pipettage.

- Concentration de magnémagnésium (Mg2+)

 

Purification d'ADN :

Actuellement, l'analyse par multiplex et PCR en temps réréel marque l'importance de la qualitéqualité de la purification de l'ADN.

ÉÉtapes de base de la purification ADN : Lyser, lier, rincer, ééluer.

Lyse : perturbation des cellules ou tissus	- Traitement enzymatique - Perturbation méca niquemécanique - Traitement àà un dédétergent
Lyse : dédénaturation ou inactivation des protéprotéines	- DéDétergents ioniques, chaleur, agents réréducteurs, uréurée et guanidine - ProtéProtéases (ex : protéprotéasine K)
Lyse : inactiver les nuclénucléases endogèendogènes	- Agents perturbateurs (ex : EDTA) - ProtéProtéases (ex : protéprotéasine K)
Lier et Rincer : séséparer l'ADN *	- ÉÉliminer les autres acides nuclénucléiques (ARN) - ÉÉliminer les protéprotéines, par extraction organique, grâgrâce au sel, ou par liaison a un support solide ( matrice de silice, colonnes d'ééchanges anioniques, particules magnémagnétiques).

* Liaison et rinçrinçage : techniques de séséparation de l'ADN d'autres matématériaux cellulaires.

Extraction organique : Lorsque du phéphénol ou une mixture de phéphénol/chloroforme est mélangémélangée àà un lysat cellulaire, deux phases se forment : une phase aqueuse et une phase organique. Les parts polaires de l'ADN et divisent dans la phase aqueuse, et les protéprotéines dénaturédénaturées et d'autres dédébris cellulaires se divisent dans la phase organique

Extraction grâgrâce au sel : Les sels dédéshydratent les protéprotéines, ce qui les rendent moins hydrophiles et donc dénaturédénaturées. Les protéprotéines dénaturédénaturées perdent de leur solubilitésolubilité et préprécipitent, ces protéprotéines dénaturédénaturées et les dédébris cellulaires sont extraits par centrifugation. Les sels sont typiquement utiliséutilisés dans des protocoles incluant du chlorure de sodium, potassium, acéacétate ou acéacétate d'ammonium.

Par liaison àà un support solide : La plupart des techniques de purification d'ADN sont basébasées sur la purification des lysats bruts par une liaison sésélective àà un support solide. Ces supports incluent matrice de silice, colonnes d'ééchanges anioniques, particules magnémagnétiques. GénéGénéralement ces méméthodes sont plus rapides et plus pratiques par rapport àà d'autres techniques car elles ne requièrequièrent pas de solvants organiques et peuvent êêtre miniaturiséminiaturisées et automatiséautomatisées.

Sources : Molecular biolgy, Lab Guide : Promega