Tampon d'extraction
Introduction
Un étape importante dans l’analyse de protéines ou d'ADN, est l'extraction de ces derniers des tissus et la purification des solution obtenus. Ces étapes ont lieu dans une solution tampon (solution qui maintient un pH à peu près stable, malgré certains changements des facteurs externes ou internes).
I) Extraction d'acide nucléique de plantes
1) Transformer les plantes lyophilisés ou déshydratés (congelés), en fine poudre.
2) Ajouter la poudre dans une solution tampon d'extraction CTAB (env. 1mL pour 30-50 mg de tissus, le ratio exact dépendant du type de la plante).
3) Incuber la solution obtenu pendant 60 min, à une température entre 55 et 60 °C, en mélangeant occasionnellement.
4) Ajouter une quantité égale de solution de chloroforme et d'alcool isoamyl (24 : 1), et mélanger.
5) Centrifuger, à température ambiante, la solution obtenue, à 1 000-5 000 g, pendant 30 à 50 min.
6) Transférer la phase aqueuse (supérieure), à l'aide d'une pipette large, dans un tube en verre.
7) Ajouter 2.5 volumes de EtOH (-20°C), ou 0.6-1 volume d'isopropanol (-20°C), et mélanger délicatement jusqu'à la précipitation de l'ADN.
- Si les brins d'ADN ne sont pas immédiatement visible, il est possible de laisser la solution reposer quelques jours ou même une nuit entière.
8) Repêcher les brins d'ADN, en utilisant une pipette de Pasteur scellée et incurvée et les transférer dans 10-20 mL, d'une solution de 75% d'EtOH et de 10mM de solution d’acétate d'ammonium. Incuber pendant 20 min, à température ambiante en mélangeant de temps en temps. Répéter une à deux fois.
- Il est possible de faire une pause à cette étape, les brins d'ADN peuvent séjourner même un ou deux jours dans la solution de lavage.
9) Placer l'ADN dans un tube pour microfuge et laisser sécher à l'air libre pendant une quinzaine de minutes.
10) Dissoudre l'ADN dans 200-800 µL de solution stérile de tampon TE (10mM tris-Ha, 1mM EDTA, pH 7.4) et centrifuger dans une microfuge avec une force de 13 000 µg pendant 10 min.
11) Mesurer la concentration en ADN et la réajuster pour avoir une concentration d'environ 0.5-0.7 µg/µL