Protocole d'extraction de l'ADN
1) Préparation du tampon d'extraction: Préchauffer le tampon CTAB dans le bain-marie a 60°C .
2) Préparation de l'échantillon : Broyer les feuilles d'haricots jusqu'à obtenir une poudre fine.
3) Ajout du tampon CTAB :
- Ajouter 7,5 mL de CTAB par gramme de feuille broyé.
4) Ajout des réactifs :
- Sous hotte il faut ajouter 10 à15 Mg de charbon actif par gramme de feuille
- 375µL de B- mercaptoéthanol par gramme de feuille
- Bien vortexer
5) Incubation :
- Incuber à 65°C pendant 1h avec agitation
6) Extraction avec solvant :
- Ajouter 7,5 mL d'un mélange chloroforme : Alcool isoamylique par gramme de feuille
- Mélanger doucement en inversant les tubes pendant 5 minutes.
7) Centrifugation à 16300 g pendant 10 minutes à 4°C et le répéter si nécessaire pour clarifier la phase aqueuse.
8) Précipitation de l'ADN :
- Récupérer le surnageant : Ajouter 2/3 de volume d'isopropanol froid à 4°C
- Inverser doucement et laisser précipiter au moins 30 minutes à - 20°C
9) Centrifugation de l'ADN : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C.
10) Eliminer le surnageant : Jeter le surnageant délicatement sans toucher le culot.
11) Lavage de l'ADN:
- Ajouter 10 mL de tampon de lavage par gramme de feuilles
- Agiter verticalement pendant 30 minutes
12) Nouvelle centrifugation : Centrifuger à 13000 g pendant 5 minutes à 4°C.
13) Séchage de l'ADN : Jeter le surnageant et laisser sécher à l'air libre pendant 20 minutes.
14) Solubiliser l'ADN : Ajouter 100µL-300µL de TE 1X pour suspendre le culot.
15) Incubation : Chauffer à 60°C pendant 10 minutes.
16) Dégradation de l'ARN :
- Ajouter 8µL de RNase pour 100µL d'ADN
- Incuber à 37°C pendant 30 minutes
17) (optionnel ) : Clarification finale: Centrifuger à 650 g pendant 2 minutes.
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