Electrophorèse
Introduction :
Le Fablab possède plusieurs types et tailles de cuves pour pratiquer l'électrophorèse:
- Cuve électrophorèse
- Kits Western Blotting (électrophorèse verticale) voir lien
Elles permettent aux utilisateurs de pouvoir respectivement :
-réaliser une PCR électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose afin de comparer l'ADN avant réplication par PCR et l'ADN obtenu
-réaliser une migration verticale sur gel de polyacrylamide
I- Principe générale de l'électrophorèse
L’électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire utilisée en biologie moléculaire et génétique pour séparer des mélanges contenant de l’ADN, de l’ARN et des protéines en fonction de leur taille et de leur charge respectives.
Le gel d'agarose : Électrophorèse horizontal de l'ADN
LeL’électrophorèse horizontale sur gel (d'agarose) est orientéune méthode utilisée dans la séparation de manière horizontale et est immergé dans un tampon. l’ADN. Une extrémité contient une anode et l’autre une cathode. L'ADN, en étant chargé négativement, migre vers l’électrode positif selon sa taille et son poids moléculaire.
Figure 1 : la principe de l'électrophorèse horizontal
Préparation d’un gel d’agarose 1%
1. Pesez 1 g d'agarose et mettez dans l’Erlenmeyer-150ml. Ajoutez 100 ml de tampon (TBE) (on peut placer le 2ème ErlenMeyer-25ml comme un bouchon dans l’ErlenMeyer-150ml)
2. Chauffez au four micro-ondes jusqu’à la dissolution complète de l’agarose. Mélangez de temps en temps.
ATTENTION : Très chaud ! Portez des gants de protection !
3. Laissez reposer le gel à température ambiante durant 10 min.
4. Assemblez le plateau avec un peigne de 13 puits et coulez le gel.
5. Ajoutez de l'intercalant de l'ADN (par exemple Atlas ClearSight DNA Stain) et mélagez.
ATTENTION : L'intercalant de l'ADN est un composé toxique ! Portez des gants !
6. Coulez le gel et laissez polymériser au moins 30 min.
7. Ajoutez le tampon de charge (TpC)
8. Retirez le peigne du gel, placez le plateau avec le gel dans la cuve de migration. Mettez le tampon de migration (par exemple TBE-0.5x) dans la cuve pour couvrir le gel.
9. Déposez les échantillons sur le gel.
10. Lancez la migration : 100 V, 60 min.
11. Observez l’ADN sous la lampe à UV
12. Utilisez le ladderDNA Ladder afin de repérer la quantité relative de l'ADN
L’électrophorèsedu horizontaleDNA surLadder gel- estmarquer unedu méthodepoids sans effort utilisée dans la séparation de l’ADN et de l’ARN
Figure 3 : cuve pour l'électrophorèse avec un peigne de 13 puits
Verticale:
La cathode est située dans la partie supérieure de la cuve et l’anode dans cellela partie inférieure. Les électrodes présentes dans chaque compartiment fournissent le champ électrique requis. Une fine couche de gel est versée entre les deux plaques verticales de verre montées. Par conséquent, la partie supérieure du gel est immergée dans la chambre supérieure et la partie inférieure du gel est immergée dans la chambre inférieure. Une fois le courant appliqué, des molécules présentent dans le tampon se déplacent de la chambre supérieure vers la chambre inférieure à travers le gel.
En raison de la taille plus petite des pores du gel d’acrylamide, une séparation précise peut être obtenue avec une résolution plus élevée.
II- L'électrophorèse des acides nucléiques
Enfin, à l'aide d'un étalon, on identifie les acides avec leur poids moléculaires (taille des molécules).
Exemple d'étalon :
Précautions:
- Attention, lorsqu'un courant est appliqué, le gel chauffe donc si le courant est trop intense, ça peut être gênant.
- Il faut bien respecter les règle de traitement déchets pour le tampon, et le manipuler avec précaution.
- Faites attention à ne pas vous faire dépasser par le temps, on risque de perdre la séparation.