Electrophorèse
I - Introduction :
L’électrophorèse - technique de séparation des molécules chargées sous l'effet d'un champ électrique appliqué par deux électrodes (négative et positive)
L'électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire utilisée en biologie moléculaire et biochimie pour séparer des extraits contenant de l’ADN, de l’ARN et des protéines en fonction de leur taille et de leur poids moléculaire.
Matériel utilisé :
- Cuve d'électrophorèse avec un peigne (pour l'électrophorèse horizontal)
- Kits Western Blot (pour l'électrophorèse verticale) voir lien
- Tampon de migration
- Agarose ou polyacrylamide
- Balance de précision
- ErlenMeyer
- Marqueur de poids moléculaires (DNA Ladder)
- Tampon de charge
- UV (visualisation)
II - Électrophorèse horizontale de l'ADN sur gel d'agarose
L’électrophorèse horizontale sur gel est une méthode utilisée dans la séparation de l’ADN. Une extrémité contient une anode et l’autre une cathode. L'ADN, en étant chargé négativement, migre vers l’électrode positif selon sa taille et son poids moléculaire.
Figure 1 : principe de l'électrophorèse horizontale
Préparation d’un gel d’agarose 1%
1. Pesez 1 g d'agarose et mettez dans l’Erlenmeyer-150ml. Ajoutez 100 ml de tampon (TBE) (on peut placer le 2ème ErlenMeyer-25ml comme un bouchon dans l’ErlenMeyer-150ml)
2. Chauffez au four micro-ondes jusqu’à la dissolution complète de l’agarose. Mélangez de temps en temps.
ATTENTION : Très chaud ! Portez des gants de protection !
3. Laissez reposer le gel à température ambiante durant 10 min.
4. Assemblez le plateau avec un peigne de 19 puits et coulez le gel.
5. Ajoutez de l'intercalant de l'ADN (par exemple Atlas ClearSight DNA Stain) et mélangez.
ATTENTION : L'intercalant de l'ADN est un composé toxique ! Portez des gants !
6. Coulez le gel et laissez polymériser au moins 30 min.
7. Ajoutez le tampon de charge (TpC)
8. Retirez le peigne du gel, placez le plateau avec le gel dans la cuve de migration. Mettez le tampon de migration (par exemple TBE-0.5x) dans la cuve pour couvrir le gel.
9. Déposez les échantillons sur le gel.
10. Lancez la migration : 100 V, 60 min.
11. Observez l’ADN sous la lampe à UV
12. Utilisez le DNA Ladder afin de repérer la quantité relative de l'ADN
Figure 2 : exemple du DNA Ladder (1 kb) - marquer du poids moléculaire
Figure 3 : cuve pour électrophorèse avec un peigne de 19 puits (ouverte - gauche; fermée - droite)
III - Électrophorèse verticale des protéines sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE
L'électrophorèse des protéines sert à la quantification relative des protéines à partir d'un extrait suite à la séparation des protéines sur gel. La séparation s'effectue en fonction de la masse moléculaire. On peut effectuer l'électrophorèse PAGE en conditions non-dénaturantes (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) mais également SDS-PAGE en conditions dénaturantes (Sodium Dodecylsulfate-PAGE).
Pour SDS-PAGE : Les protéines sont dénaturées dans un tampon de charge (tampon laemmli) contenant du
SDS (charge négativement les protéines en les déroulant) et un réducteur (β‐mercaptoéthanol ou
DTT) qui détruit les ponts disulfures. Les protéines, alors chargées négativement, migrent dans le
gel de polyacrylamide sous l'effet du champ électrique, en fonction de leur poids moléculaire apparent
*On pourrait éventuellement utiliser le gel d'agarose mais en raison de la taille plus petite des pores du gel de polyacrylamide, une séparation plus précise peut être obtenue
Figure 4 : principe de l'électrophorèse verticale
Les étapes principales
- Préparation des échantillons. Dénaturation des protéines par SDS et la réduction des ponts disulfures par un réducteur.
- Préparation de la cuve d’électrophorèse et du gel (Adapter la cassette de gel dans son support)
- Remplissage de la cuve. Remplir le compartiment intérieur (entre la cassette de gel et la plaque de barrage) et le compartiment principal avec du tampon de migration
- Dépôt des échantillons sur le gel
- Mise en route de l’électrophorèse
Figure 5 : Exemple de la migration des protéines sur gel
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