Electrophorèse
Introduction :
Le Fablab possède plusieurs types et tailles de cuves pour pratiquer l'électrophorèse:
- Cuve d'électrophorèse
- Kits Western Blot (électrophorèse verticale) voir lien
Elles permettent aux utilisateurs de :
-réaliser une PCR électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose afin de repérer la quantité relative d'ADN
-réaliser une migration verticale des protéines sur gel de polyacrylamide
I - Principe générale de l'électrophorèse
L’électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire utilisée en biologie moléculaire et génétique pour séparer des mélanges contenant de l’ADN, de l’ARN et des protéines en fonction de leur taille et de leur charge respectives.
II - Électrophorèse horizontale de l'ADN sur gel d'agarose
L’électrophorèse horizontale sur gel est une méthode utilisée dans la séparation de l’ADN. Une extrémité contient une anode et l’autre une cathode. L'ADN, en étant chargé négativement, migre vers l’électrode positif selon sa taille et son poids moléculaire.
Figure 1 : la principe de l'électrophorèse horizontalhorizontale
Préparation d’un gel d’agarose 1%
1. Pesez 1 g d'agarose et mettez dans l’Erlenmeyer-150ml. Ajoutez 100 ml de tampon (TBE) (on peut placer le 2ème ErlenMeyer-25ml comme un bouchon dans l’ErlenMeyer-150ml)
2. Chauffez au four micro-ondes jusqu’à la dissolution complète de l’agarose. Mélangez de temps en temps.
ATTENTION : Très chaud ! Portez des gants de protection !
3. Laissez reposer le gel à température ambiante durant 10 min.
4. Assemblez le plateau avec un peigne de 19 puits et coulez le gel.
5. Ajoutez de l'intercalant de l'ADN (par exemple Atlas ClearSight DNA Stain) et mélagez.langez.
ATTENTION : L'intercalant de l'ADN est un composé toxique ! Portez des gants !
6. Coulez le gel et laissez polymériser au moins 30 min.
7. Ajoutez le tampon de charge (TpC)
8. Retirez le peigne du gel, placez le plateau avec le gel dans la cuve de migration. Mettez le tampon de migration (par exemple TBE-0.5x) dans la cuve pour couvrir le gel.
9. Déposez les échantillons sur le gel.
10. Lancez la migration : 100 V, 60 min.
11. Observez l’ADN sous la lampe à UV
12. Utilisez le DNA Ladder afin de repérer la quantité relative de l'ADN
Figure 2 : l'exemple du DNA Ladder (1 kb) - marquer du poids moléculaire
Figure 3 : la cuve pour électrophorèse avec un peigne de 19 puits (ouverte - gauche; fermée - droite)
III - Électrophorèse verticale des protéines sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE
LaL'électrophorèse cathodedes estprotéines situéesert dansà la partiequantification supérieurerelative des protéines à partir d'un extrait suite à la séparation des protéines sur gel. La séparation s'effectue en fonction de la cuvemasse moléculaire. On peut effectuer l'électrophorèse PAGE en conditions non-dénaturantes (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) mais également SDS-PAGE en conditions dénaturantes (Sodium Dodecylsulfate-PAGE).
Pour SDS-PAGE : Les protéines sont dénaturées dans un tampon de charge (tampon laemmli) contenant du
SDS (charge négativement les protéines en les déroulant) et l’anodeun réducteur (β‐mercaptoéthanol ou
DTT) qui détruit les ponts disulfures. Les protéines, alors chargées négativement, migrent dans lale
gel partiede inférieure.polyacrylamide Lessous électrodesl'effet présentes dans chaque compartiment fournissent ledu champ électriquelectrique, requis.en Une fine couchefonction de gelleur estpoids verséemoléculaire entreapparent
*On deuxpourrait plaqueséventuellement verticalesutiliser de verre montées. Par conséquent, la partie supérieure dule gel estd'agarose immergéemais dans la chambre supérieure et la partie inférieure du gel est immergée dans la chambre inférieure. Une fois le courant appliqué, des molécules présentent dans le tampon se déplacent de la chambre supérieure vers la chambre inférieure à travers le gel.
Enen raison de la taille plus petite des pores du gel d’acrylamide,de polyacrylamide, une séparation plus précise peut être obtenue avec une résolution plus élevée.
Figure 4 : principe de l'électrophorèse verticale